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给力高速逆流色谱 大制备的不二选择

http://www.cphi.cn   2017-06-16 09:22 来源:CPhI制药在线 作者:荆门山

引子:前阵子,我通过了博士答辩会,会议结束后,一位小生递来一张名片,并且带来了一个声音:在寻找新活性化合物制备上,如果用高速逆流色谱,会不会让你的答辩更圆满呢?

       背景:

       在医药研发领域,有一项很重要的工作,就是制备样品,尤其是在new api发现上面。

       一般处理方法是样品初处理后,通过层析色谱柱进行富集,之后再进入HPLC制备。

       我的博士三年几乎都是在不停地处理获得样品,再大量地层析处理后,一次又一次打针到HPLC里头,虽然很是单调乏味,不过新物质的发现总会让单调中带来些刺激,能够支持自己不懈怠地继续紧进行下去。

       但是,这位小生的一句话,让我来了兴趣,似乎他有更好的办法,获取一样的结果。

       晚餐上,他给我介绍了一种全新的处理方式,让我眼界大开:

       什么叫HSCCC?

       餐厅里头,曲萃(小生名字)告诉我,高速逆流色谱就是萃取,就像是分液漏斗里头的两相一样,所不同的是,萃取级数极高,每秒可达17次,而且不停地更新萃取液,更新的同时就是分离,萃余相永远接触的都是新的萃取液,看起来就像是两相逆流碰撞,所以叫做高速逆流萃取。

       HSCCC的原理

       我听着来了兴趣,"你怎么做到这点呢,这么高级次的萃取,而且还能够流动地分离,还是逆流的?"

       小曲也不着急,端起金龙泉呷了一口:

       "这话说起来就远了,得先说说Ito博士(美国国立卫生院)。

       Ito博士比较喜欢鼓捣一些东西,这高速逆流色谱的核心就是他发明的。

       HSCCC里头起分离作用的,就是一个螺旋管。

       萃取的两相,轻的在上面飘着的,叫做轻相,在下头的叫做重相,把螺旋管沿着其管径方向平放,先把轻相注射进去,充满螺旋管,然后再慢慢地把重相打进螺旋管。

       过一段时间,平衡后,会发现,螺旋管是里头轻相和重相是成段分布的,把螺旋管看成圆环,轻重两相各占一半的体积在两侧。"

       听小曲说到这里,对于这一点,我倒是没什么疑问,这种流体运动规律,很容易理解的,重力作用下,轻相往上跑,重相往下跑,只要不注射的太快,分段排布,不难做到,但是这和HSCCC有啥关系呢?

       小曲看着我有些不耐烦了,脸色有点尴尬,接着说:

       "如果样品在轻相里头,重相不停地打进去呢?"

       我一听,有门----这种方式,完全可以做到连续不断地萃取,而且随着重相,也是流动相的不停注射进去,完全可以萃取同时也自动分离出来了。

       "但是,这种蜗行牛步,和一秒钟萃取十七八次是风马牛不相及的",我马上提出我的观点。

       小曲倒是镇定,他说,"如果螺旋管转动起来呢,沿着自己的轴线进行自转,如何?"

       我是一个科普迷,他这么一说,让我想起以前读过的书,关于阿基米德的,传说,阿基米德用一个螺旋管,当然,是比较粗大的那种,快速地旋转,可以把水从河里提上来,用来灌溉。

       当时我就想明白了,"螺旋管自转,会使流体沿着螺旋管一端流动。"

       "不错!要是螺旋管里面有两种密度不同的流体,会出现什么情况?"

       "重的往前面跑,轻的落在后面,阿基米德那个螺旋管,其实就是水和空气的比较,两个密度差别特别大而已!"我说。

       小曲很惊讶我的领悟和理解这么快,向我举起了酒杯。话说,金龙泉啤酒还是不错的,很爽口甘甜,据说是荆门龙泉书院里头的泉水酿造的。

       "那么,如果转速到了一定程度后,是不是螺旋管的一端全部都是重相,另一端全部都是轻相?如果我从重相要跑出的那端打进轻相,岂不是更好?"

       我细细一琢磨,如果轻重两相分段分布,螺旋管自转,重相跑一段跑得更快,到一定程度后,可以把轻相往后方挤压,这样,是完全可以达到的,而从重相要跑出的一端打进轻相,是可以很好地解决轻相进入速度,也就是流动相的流速的。

       "这个设计堪称精妙!"我忍不住赞道。

       "先别着急,还有更精妙的"

       "螺旋管这种轻重两相单向分布到两端,是收到螺旋管自转螺旋力和重力的双重影响的,螺旋力可以用自转速度来调节,但是重力就那么大点儿,不够用呀。"小曲瘪瘪嘴。

       "这倒是个问题"我皱眉道,"你们怎么解决的?"

       小曲诡异地一笑,"要是我把螺旋管绕着一个轴线做公转如何,就像月亮绕着地球跑那样?"

       "大妙,离心力当成重力来使用了,可以通过转速来调节离心力,这样离心力和螺旋力都属于可控制了,相对的那点重力忽略不计,这样可以有很大的设计空间了,妙极!"

       "不错的,HSCCC就是这样设计出来的,螺旋管的公转和自转,产生流体的单向分布,然后从相反的方向进另一相,这样可以保证整个过程始终都是单向排布,萃取过程很稳定。"

       我恍然大悟,但是,这与我的课题有什么关系呢?

       HSCCC的分离制备基础

       "您现在制备单一的化合物,都是采用的柱色谱法吧,"小曲没有直接回答。

       "对呀"

       "我做过药厂的QC,一次打针少点5uL,多点也就是100uL了,对吧?"

       "是呀,不都是这样吗?"

       "嗯,如果一次打针就可以达到1ml,如何?20mL呢?80mL?甚至200mL呢?"

       "这不可能吧,你这是扯犊子了!"我听着难以置信。

       "林老师,先不着急,这个不是柱色谱,所以不用柱色谱的思维方式,柱色谱上不能完成的事情,这里未必不能完成。"小曲优哉游哉,不急不慢地继续说。

       "刚才说了,HSCCC是在螺旋管里面完成分离的,如果螺旋管的容积是30ml,那么,我进样1mL有什么不行呢,如果300mL,进样20mL没问题吧,如果是4800mL,进样200mL,完全是可以的!"

       "样品注射进入到固定相流体中,我再进流动相,只要目标物质的分配系数合适,完全是可以非常好地分离滴。"

       我听着,也是这个道理,"那么,怎么才叫比较好的分配系数呢?"

       看我进了角色,小曲高兴了,"一般而言,目标物质在固定相和流动相重的分配系数的比值应该在0.5到2之间。"

       "这个比值,有什么讲究?我高点儿不是更好?"

       "欲速不达,太高了,流动相洗脱分离时间太长,出来的峰太宽,收集的体积太多,太低了,流动相洗脱太快,可能都分离不好。"

       "喔,那么,怎么测定这个比值呢?"

       "这个简单了,用柱色谱法就行,目标物质的饱和溶液分别进入到HPLC,相同条件下比较峰面积即可,或者用TLC大致比较一下斑点距离基线的距离,这个最简便。"

       "嗯,听着是不麻烦",我心里在盘算,进样量1mL,那可省了我多少时间呀,多少个20uL能够凑得起1mL,50个!!我的心在滴血了,要是能够早点有这个办法,我可是省下了不少时间了,哎,等等,我心里一个激灵,"这个HSCCC,进样1mL的话,要多长时间分离呀,可别几天几夜的。"

       "1mL进样量是一般HSCCC仪器里面最小的进样量了,这个分离时间一般15-30min,"小曲不痛不痒地说道。

       我心里一阵暗淡,这个确实可以省下不少时间,但是,"你说分离的基础是要有合适的分配系数,那么,找这个容积体系,不是要花不少时间?你们怎么处理的?"

       "这个早就有方法论了。一般物质按照极性可以分为强中弱三种,对应三种物质,有三种不同的溶剂体系,根据具体的情况,进行适度的微调,即可达到满意的结果,而且这是一点都不费事的,用TLC找条件,速度还是很快的。况且,大多数的关于HSCCC应用的文章,咱这边都有收录,您要是要查,关键字加Enter就可以参详了。"

       "这个听起来不错。那,HSCCC可以分离哪些物质呀?"

       HSCCC的应用范围

       "原则上是没有限制的,只要能用萃取进行分离的,HSCCC是都可以的,关键是溶剂体系,找好分配系数,而且,就像柱色谱有天生的缺陷一样,比如可能因吸附导致活性物质失活,或者因洗脱产生出柱子里面的新杂质导致有干扰峰一样,这个答辩会上,好多老师也说了吧,不止您,其他几位博士的报告上也有这些问题,还有柱子的使用成本等,或者拖尾、死吸附等。"

       "HSCCC最怕的表面活性剂,它是萃取体系,两相有界面,如果加了表面活性剂,那就不行了,所以对于表面活性能力特别强的物质,HSCCC是不适用,但像人参皂苷这些有表面活性能力的,HSCCC的分离效果还是非常不错的。"

       "这个说起来,几乎是无敌了,和HPLC搭对儿不错。"我忍不住赞道。

       HSCCC大制备上的不二选择

       "嗯,做制备,HSCCC是非常不错的,制备量大,从几百毫克到100g甚至更大,都是没问题的。它还有一个更神奇的地方。"

       "么事东西?"我心里有点不爽他老是卖关子,有点不客气了。

       "线性放大!小样品摸条件,大批量同条件下,直接使用,线性放大!"

       "有这么神奇?"我是被惊到了,如果真这样的话,从实验室到工业化生产,可以一步实现,利润巨大。越是难分离的物质,产量越少,价格比高,需求必大,要是能够实现这点,那是无法想象的。

       "就是这样的,HSCCC和柱色谱不同,HSCCC增加螺旋管长度并线性扩大,条件不变,完全没问题,如果是柱色谱的话,改变了柱子的长度或者横截面积,那之前的条件白摸了。"

       这点我是深有体会的,我点点头,看看时间,也差不多是回去的时候了。

       接下来的几天,我专门研究了HSCCC,只得出一个结论:

       给力高速逆流色谱 大制备的不二选择!

       

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