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如何解决IgG样BsAbs的错配问题?

http://www.cphi.cn   2017-11-09 09:50 来源:CPhI制药在线 作者:Tumour

近期,来自德国的研究者综述总结了近年来解决双抗重链和轻链的错配技术,克服了重轻链的错配问题,在此和大家分享。

       单克隆抗体在许多适应症,如癌症、免疫和其他疾病中引起了可持续性的兴趣。然而,临床相关的抗体通常只针对一个明确的结合靶点,限制了其在多重介质和机制引起的疾病中的治疗潜力。因此,针对双重靶点策略的双特异性抗体(BsAbs)应运而生。BsAbs由两个具有不同靶向的单链组成,它可以同时靶向两个不同的抗原表位。和传统的单克隆抗体或抗体联合疗法相比,BsAbs达到了更好的治疗效果,如Removab(EpCAM/CD3)和Blincyto(CD19/CD3),并且已经进入美国和欧洲市场。

       全IgG的BsAbs由两个不同的重链和轻链组成,生产中会导致大量的错配分子出现。在两个不同的重链和两个不同的光链的共同表达下,每一个重链都可以形成同源二聚体或异源二聚体,同时又可以与两个轻链连接起来。从一个随机组合的数学角度来看,这会导致16条链的排列,其中有10种独特的双抗组合,只有一种会显示出我们需要的重链异质二聚体,并与不同的轻链(图1A)进行正确的配对,理论上的产量只有12.5%。这种低概率损害了bsAbs的可制造性。现在,蛋白质工程的重大进展已经建立了多种方法,以确保特定的重链(图1B和2)和特定的轻链配对(图1C和3),从而促进了BsAbs的临床应用的发展。近期,来自德国的研究者综述总结了近年来解决双抗重链和轻链的错配技术(Simon Krah, et al., Engineering bispecific antibodies with defined chain pairing. New Biotechnol. (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.nbt.2016.12.010),克服了重轻链的错配问题,在此和大家分享。

图1[BsAbs错配示意图和可用的解决方案。

       图1[BsAbs错配示意图和可用的解决方案。A:4种不同链的随机组合产生10种可能的独特BsAbs组合,理想的BsAbs产率为12.5%;B:轻链可能产生三种组合,使用重链异质化技术可使重链异质率达到90%;C:通过与B的类比,使用同源重-轻链匹配技术可使同源重链匹配正确轻链的产率达到90%。]

       重链异源匹配技术

       1996年,Carter等人(Genentech, Inc)率先通过引入"knob-in-hole"技术(KiH),设计出了一种具有立体互补的CH3界面。为此,引入大量的氨基酸残基,如色氨酸和酪氨酸,创造了一个"把手",而像苏氨酸和丙氨酸这样较小的氨基酸残基,则在相反链上形成了一个互补的"孔"。该技术通过合理的设计和通过噬菌体展示技术得到进一步完善,T366W得到了Knob突变,T366S、L368A和Y407V形成了相应的孔(图2A)。

图2[双特异性抗体中重链异质化技术。

       图2[双特异性抗体中重链异质化技术。A:Knob-in-hole技术;B:两种带不同电荷的重链与单链scFv技术相结合,保证了正确的BsAbs匹配;C:铰链区额外突变形成静电作用;D:两个半抗体表达和温和还原反应后,在CH3领域的两个突变促进了体外的重链匹配;E:SEED技术采用IgG和IgA片段交替,产生了两个不对称的链,容易形成异源二聚体;F:人造的亮氨酸拉链强化了重链的异质化,并且可以分离出后切除。]

       另一个重链的异质化技术包括使用相反的静电电荷,例如两个带正电荷的赖氨酸(D399K,E356K)在一个链上,两个带负电荷的氨基酸在另一个链上(K409D,K392D)(图2B)。类似的方法不仅在CH3(链A:L368E,链B:K409R),还包括了IgG1(图2C)的铰链区域(链A:221E和228E,链B:221R和228R)。

       此外,在生理条件下,体内有一种自然发生的双特异性IgG4的形成过程。在分子重排过程中,一种抗体的一半与另一种IgG4的半抗体相互交换,形成了BsAbs的随机组合。突变研究揭示了核心铰链残基S228和CH3残基R409在这个抗体臂交换(FAE)中作用。虽然抗体臂交换的短暂现象可能会改变IgG4的疗效,但当这些突变应用到IgG1等类型抗体时可以用于BsAbs的生产。DuoBody抗体臂交换技术采用分别表达携带不同点突变(F405L或K409R)的抗体臂,然后通过温和的二硫键反应的实现分离(图2D)随后形成BsAbs。

       SEED重链的异质化技术,是在CH3中交替使用IgG和IgA片段,引入了更大的变化。这导致了两个不完全相同的反平行链,被指定为GA和AG,建立了一个非对称的异质二化界面(图2E)。

       最重要的是,正确的重链配对可以通过在重链C末端融合一个人工异聚亮氨酸拉链(LUZ-Y)实现。在中国仓鼠卵巢细胞共表达后,亮氨酸拉链被切除(图2F)。

       轻链匹配技术

       图3总结了当前的结构设计上的方法,以确保重链和轻链的正确配对。在CrossMab中,重链CH1和轻链CL在一个Fab中进行了交换,为正确的重轻链的配对提供保障(图3A)。另一种替代方法是将一个抗体臂上CH1和CL替换为T细胞受体恒定区α和β结构域,同时保留其他的Fab且使其不受影响(图3B)。

图3[双特异性抗体中轻链和重链的正确匹配技术。

       图3[双特异性抗体中轻链和重链的正确匹配技术。A:CrossMab技术是在箭头指示的抗体臂上对CH1和CL域进行交换;B:在IgG/T细胞受体(TCR)嵌合体中,TCR恒定区α和β结构域在一个Fab臂中取代CH1和CL域;Fab结合工程技术是在重链和轻链结合处引入突变;D:在重链和轻链结合处引入带相反电荷的氨基酸,实现同源重链和轻链的配对;E:确定了两种不同的重链和相同的轻链(体外筛选或体内免疫)之后,不需要对重链和轻链进行任何工程改造。F:噬菌体展示获得的binder由相同的重链和不同的lambda(λ或kappa(κ)轻链组成,形成BsAbs。]

       除了结构域的互换,Fab结合方法还依赖于重链的非二聚化方法,如空间互补和静电结合。Lewis等通过计算机模型设计了Fab接口。最佳结果在一个Fab中突变VH/CH1(Q39K、R62E、H172A、F174G)和VL/CL(D1R、Q38D、L135Y、S176W),在另一个Fab中突变VH/CH1-Q39Y)和VL/CL-Q38R(图3C)。与他们的重链异聚策略类似,Liu等也运用了电荷突变来迫使同源的重链/轻链相互作用(图3D)。他们提出的突变体V23具有VH/CH1突变Q3K、Q105K、S183D和VL/CL突变Q38D、A43D、S176K以及在另一个抗体臂上VH/CH1突变Q39D、Q105D、S183K和VL/CL突变Q38K、A43K、S176D,产生了非常高的BsAb。

       2010年,Knobs-into-holes相同轻链bsAb产生。研究者首先在大肠杆菌中分别表达了两种Knob或Hole半抗体,然后形成异质二聚体,在体外进行功能分析后,生成了一种新的BsAb。为此,用任意选择的轻链移植到综合多样性人类重链残基中构建了Fab噬菌体抗体库。最终,获得了一种具有抗原结合高亲和力的Fc?RIIb和FcεRI双特异性抗体。这种BsAb用大肠杆菌中生产,高产量和纯度由knobs/holes重链和相同轻链组成(图3E)。

       此外,最近还产生了一种共同重链双特异性抗体的方法,称为"λκ-bodies"(图3F)。对几种抗原的选择,选择针对对个抗原,包括HER2、EGFR和EpCAM,揭示了不同的κ和λ轻链。VH、Vκ和Vλ都是在人类胚胎肾 脏单层上皮细胞(峰值)细胞中表达的,在统计上,有25%κκ-body、25%λλ-body和50%κλ-body。这些混合物可以先利用Protein A然后利用λ亲和层析和κ亲和层析三步色谱层析过程中得到纯化。双特异性分子的功能已经被证实可以同几种抗原结合,而且这种λκ-bodies双特异性抗体具有可制造性。

       来源:Simon Krah, et al., Engineering bispecific antibodies with defined chain pairing. New Biotechnol. (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.nbt.2016.12.010

       Tumour,食品科学与工程专业学士,国家三级公共营养师,生物化工专业硕士,目前为医药行业从业者,致力于癌症靶点及IRs抗体的研究开发,工作之余时刻关注医药行业动态和进展,同时从健康安全角度热切关注食品行业动态,为人类健康传播和提供科学的食品知识。

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