• 产品
  • 供应商
  • CAS号
  • 采购
  • 资讯
  • 会展活动

热搜关键词: 甘露醇价格 头孢呋辛 山梨酸钾 磷酸三钠 稳定剂 >>

您的位置:首页 >> 资讯 >> 热点在线 >> 对α-1-抗胰蛋白酶糖基化进行直接的LC-MS/MS分析

对α-1-抗胰蛋白酶糖基化进行直接的LC-MS/MS分析

https://www.cphi.cn   2018-03-05 11:31 来源:生物制品圈 作者:ZXQ

已经开发了以液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)为基础的方法来区分糖肽的核心-和天线-岩藻糖的糖基化。通过完整的糖肽分析可以解析不同的糖基化位点(异质性)以及每个位点上可能存在的多种糖链(微观异质性)。

       已经开发了以液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)为基础的方法来区分糖肽的核心-和天线-岩藻糖的糖基化。通过完整的糖肽分析可以解析不同的糖基化位点(异质性)以及每个位点上可能存在的多种糖链(微观异质性)。本研究中使用含有核心-和天线-岩藻糖糖基化位点的血清糖蛋白α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)。使用唾液酸酶去除唾液酸以简化糖基化的微观异质性,并可以增强具有类似糖链结构糖肽的MS信号。使用β1-3,4半乳糖苷酶来区分核心-和天线-岩藻糖基化。我们发现源内裂解严重影响低丰度糖链修饰的糖肽鉴定和定量。因此需要对质谱仪参数进行设定以最小化源内裂解。使用三步法质谱裂解策略进行糖肽的识别,并通过pGlyco软件注释和人工检查进一步确定。用于初始糖肽片段化的碰撞能量对提高氧鎓离子的检测以及更好地选择Y1离子(肽+GlcNAc)至关重要。结构配置显示A1AT糖肽的所有3个糖基化位点都含有复杂的N-糖链结构:Asn70位点含有没有岩藻糖基化的二天线糖链;Asn107位点含有核心-和天线-岩藻糖基化的二天线,三天线和四天线糖链;Asn271位点含有核心-和天线-岩藻糖基化的二天线和三天线糖链。Asn107位点上的核心-和天线-岩藻糖基化的相对强度与A1AT蛋白相似,表明Asn107位点的糖基化水平比其他2个位点高得多。

       1.前言

       异常蛋白质的糖基化尤其是岩藻糖基化与各种疾病相关,例如癌症[1]。核心岩藻糖基化是指岩藻糖连接到N-糖链的核心-N-乙酰葡糖胺上形成的,而天线岩藻糖基化则是岩藻糖连接到天线-N-乙酰葡糖胺或半乳糖上形成的。已经发现一些蛋白质的核心-或天线-岩藻糖基化的变化指示各种癌症的发生。例如,血清中α-胎儿球蛋白(AFP-L3)的核心-岩藻糖基化水平的增加被发现与肝细胞癌有关[2]。基于免疫分析法和LCA对核心-岩藻糖基化糖蛋白的高亲和力,AFP-L3使用小扁豆凝集素(LCA)印迹试验进行检测[3]。另一个例子是CA19-9,一种天线-岩藻糖基化唾液酸化路易斯A(lewis A)结构。血清中CA19-9水平的升高是胰 腺癌最广泛使用的临床指标[4]。使用唾液酸化路易斯A结构的特异性抗体通过免疫分析法来检测CA19-9[4]。该方法依赖于特异性抗体,因此不能轻易应用于其他糖蛋白。除了上述基于免疫分析法的方法之外,用于核心-和天线-岩藻糖基化分析的另一种常规方法涉及各种岩藻糖苷酶的组合以及从糖蛋白中释放糖链后通过HPLC对糖链进行几个循环的分离[5]。尽管最近开发的固定化PNGase F消化程序使糖链可以从糖蛋白中快速释放[6],但该岩藻糖苷酶消化的方法是冗长的。更重要的是,大多数蛋白质具有多个岩藻糖基化位点,上述分析丢失了位点特异性信息,因此不能提供蛋白质的核心-或天线-岩藻糖基化异常的直接证据,而该证据是精准诊断的关键。

       许多研究一直在探索基于MS的完整糖肽分析,例如改善质谱仪的灵敏度,分辨率和裂解模式以及开发用于糖肽数据分析的软件[7,8]。这些研究过程中一直使用CID,ECD,ETD,EThcD,低能量和高能量HCD等裂解方式或这些裂解方式的组合来阐明糖肽的结构[9-11]。已经开发了用于阐明这些谱图的几种不同软件,其中Byonics[12]和GPQuest[13]是目前使用最广泛的软件。然而Byonics依赖于基于肽段序列的得分,低估了糖肽的假阳性发现率[14],GPQuest需要一个样品来源的肽数据库来匹配糖肽,这使得实验更加复杂[13]。在这里,我们使用了Yang PY和He SM团队中新开发的pGlyco软件来帮助糖肽的质谱分析。pGlyco使用HCD MS2产生的氧鎓离子来过滤糖肽,在Y1离子上使用HCD MS3进行肽段测序,并使用CID MS2进行糖链的解析[15]。pGlyco2.0是一个更新版本,它使用了阶梯式HCD碰撞[14]。虽然pGlyco中MS3的参与使得扫描速度稍慢,但与pGlyco 2.0相比,它能够手动检查具有更复杂片段的糖链结构和肽段序列。因此,我们使用pGlyco作为首选方法。

       单独使用LC-MS/MS,由于它们在C18色谱柱上相似的保留时间和糖肽相同的质核比[16],因此通常难以区分核心-和天线-岩藻糖基化,并且在MS/MS裂解过程中岩藻糖可能发生从天线-到核心-位置的迁移[17]。糖链衍生化例如全甲基化能够解决岩藻糖迁移的问题,但是在衍生化之前需要从糖肽中释放糖链,以致位点特异性信息丢失[17,18]。因此,我们试图开发一种在进行LC-MS/MS之前区分核心-和天线-岩藻糖基化的方法,并使用pGlyco促进核心-和天线-岩藻糖基化鉴定和半定量的质谱分析。在本研究质谱分析前,我们应用唾液酸酶和半乳糖苷酶双重消化来区分核心-和天线-岩藻糖基化。使用唾液酸酶去除唾液酸以简化糖基化微观异质性并增强糖肽的MS信号。β 1-3,4半乳糖苷酶(来自牛睾丸)用于区分核心-和天线-岩藻糖基化,其中半乳糖苷酶不能从天线-岩藻糖基化的路易斯结构释放半乳糖[19]。

       血清蛋白α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的岩藻糖基化水平已被确定为各种癌症[20,21]和炎症[22]的潜在生物标志物。本研究中,糖肽的唾液酸酶和半乳糖苷酶双重消化之后直接进行LC-MS/MS分析,而不从糖肽中释放糖链。通过对A1AT的糖肽的成功鉴定和半定量以及核心-和天线-岩藻糖基化的明确区分,解析了糖基化位点和每个位点上多种可能的糖链。

       2.材料方法

       2.1胰蛋白酶将蛋白质消化成肽段:我们向10μg α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)中加入10μL 50mM的碳酸氢氨并用移液器吹打充分溶解样品。溶解的A1AT样品用10mM tris(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)在37℃下还原30分钟并用20mM碘乙酰胺(IAA)在室温下避光烷基化15分钟。用50mM碳酸氢氨将样品溶液稀释3倍,加入1μL 0.5μg/μL的胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)在37℃下孵育16小时。最后95℃下孵育5分钟使胰蛋白酶失活并通过真空离心机干燥样品。

       2.2糖肽的富集和缓冲液置换:使用3K Ultra离心过滤器-15(Millipore Amicon)进行糖肽富集和缓冲液置换。离心机设置为7,500g,1小时,重复3次将缓冲体系由上述体系置换为25mM的乙酸钠(pH5.5)。修饰的糖肽大于3K,因此只有小于3K的非糖肽类才能透过3K滤膜。

       2.3唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化:对于唾液酸酶和半乳糖苷酶消化,将30μL 25mM乙酸钠溶液中的糖肽混合物与15mU(3μL)来自大肠杆菌((Prozyme, Hayward, CA))中表达的非特异性α2-3,6,8,9唾液酸重组酶以及75mU(3μL)来自牛睾丸(Prozyme,Hayward,CA)的β1-3,4半乳糖苷酶在37℃下温育18小时以除去所有唾液酸酸残基和半乳糖,前提是岩藻糖没有连接到N-糖链末端的N-乙酰葡糖胺上。糖苷酶在95℃下5分钟失活。

       2.4 C18脱盐:加入三氟乙酸(TFA)直到pH值达到2。用200μL含有0.1%TFA的50%乙腈溶液活化C18柱(Fisher Scientific,San Jose,CA)5次,并用0.1%的TFA水溶液平衡3次,每次1500g/min离心1min。将多肽与C18珠子结合5次,然后用0.1%的TFA洗涤3次通过上述离心程序去除非特异性结合;使用20μL含有0.1%TFA的50%乙腈溶液通过上述离心程序进行洗脱。重复洗脱一次,然后通过真空离心机干燥合并的洗脱液。

       2.5 糖肽的LC-MS鉴定

       Nano LC-MS/MS工作条件如先前研究中所述[23]。C18毛细管柱(100μm×15cm;3μm粒径,200?))(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA)用于LC分离,梯度洗脱使用Ultimate 3000 nanoLC系统(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA),流速为350nL/min。流动相A为0.1%的甲酸水溶液中含有2%的乙腈,流动相B为乙腈溶液中含有0.1%的甲酸和2%的水。分析方法的梯度时长100分钟,其中平衡10分钟后,流动相B的梯度组成为:2min内由3%上升到7%,8min内再从7%上升到14%,55min内从14%上升到25%随后进行洗涤和平衡步骤:其中流动相B在5min内增加至90%并保持8min,然后在0.1min内返回至3%并保持17min。

       使用以正离子模式操作的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(赛默飞世尔科技公司,圣荷西,美国加州)进行分析。ESI喷雾电压和毛细管电压的设定如下文所述。对每个样品进行两次LC-MS分析。每次运行包括两个连续的MS扫描类型。在第一次运行中,通过低能量HCD MS2检测氧鎓离子138.05来选择糖肽;来自糖肽的Y1离子(肽+GlcNAc)通过高能量HCD MS3用于肽段测序。在第二次运行中,在通过低能HCD MS2选择糖肽后,将所选择的糖肽进行CID MS2用于糖链的结构分析。正如结果部分所讨论的那样,为了更好地检测氧鎓离子,更好地选择Y1离子以及更好地裂解Y1离子和糖链,每个裂解步骤的碰撞能量也进行了优化。全扫描定义质量范围为m/z 600到1800,MS/MS采用速度模式。

       2.6 糖肽鉴定的数据库检索:

       He SM团队开发的搜索引擎pGlyco和pFind用于糖蛋白的分析。两次LC-MS运行的原始数据首先需要一致以确保两次运行中相同前体离子的保留时间相同。pFind通过使用来自第一次LC-MS运行的MS3谱图来进行Y1肽段鉴定:(1)固定化修饰:半胱氨酸的脲基甲基化(+57.021Da);(2)动态修饰:甲硫氨酸氧化(+15.995Da)和N-乙酰己糖胺(+203.075Da);(3)允许错过一次裂解;(4)肽段离子公差:15ppm;(5)碎片离子公差:25ppm。从第一次LC-MS运行中鉴定的Y1肽段和第二次LC-MS运行的原始数据被输入到pGlyco中进行糖肽匹配和评分。所有鉴定的糖肽均由EURO CarbDB开发的GlycoWorkbench软件进行手动检查[24]。根据糖生物学基础[25]使用糖链的命名规则,根据NIBRT GlycoBase使用缩写。

如果这篇文章侵犯了您的权利,请联系我们。

市场动态更多 >>
主编视角更多 >>
热门标签更多

投稿合作联系方式: Kelly.Xiao@imsinoexpo.com 021-33392297

地址:上海市徐汇区虹桥路355号城开国际大厦7-8楼 200030

CPHI 网上贸易平台: CPHI.cn| Pharmasources.com| CPHI-Online.com
客服热线:  86-400 610 1188 (周一至周五 9: 00-18: 00)