抗体生产成本有望降低到15美元/克以下

       21世纪被称为生命科学和生物技术的时代，生物制药行业在过去的20年间有了长足的发展，特别是抗体类药物的销售额逐年攀升。目前，大部分抗体类产品是以batch或fed-batch的模式进行细胞培养和表达。随着多个重磅原研生物药的专利到期，为了满足临床未及的需求和降低原研生物药的昂贵医疗费用，越来越多的制药企业进入生物类似药的开发领域，这进一步加剧了生物类似药的竞争，企业成本压力日益凸显，因此，越来越多的制药企业将上、下游工艺由批次生产向连续生产转移，以此获得更高的抗体产量。

       图1 抗体药物生产工艺流程图

       一份成本研究报告表明，单抗产品从批次转到连续生产将会节省70%的生产成本投入。2017年11月2日，药明生物与颇尔公司宣布在上海创建联合实验室，携手开发完整的单克隆抗体连续生产工艺。通过此次联合实验室的合作，药明生物计划近期将该工艺放大至500升规模，抗体生产成本则降至30-50美元/克；之后将放大到多个1000升规模，抗体生产成本便有望降低到15美元/克以下。

       包括FDA、EMA和PMDA在内的法规监管部门都支持连续流生产工艺这种生产方式的革新，接受连续流生产的药物制品。监管部门认为，连续流生产的好处在于更少操作步骤的集成化生产过程，需要更少的设备和设施，同时这种新兴的技术适用QbD的工艺设计原则，有潜力提供更高的生产效率，有的灵活性。监管部门对于连续生产工艺适用于现有的法规监管体系达成共识，对于连续生产工艺没有特殊的法规要求。同时，FDA、EMA 和PMDA等部门都有专门的新技术团队来鼓励和帮助新技术的实施和应用。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了几项连续流的生产，正在积极推动医药行业接受这项新技术。FDA认为使用连续流生产技术可以降低生产中的人为差错，提高药品质量。

       越来越多的制药公司都在尝试连续流的生产，并且认为连续生产对生物药品生产能带来诸多好处：（1）从上游开始的连续性生产工艺可节省占地空间、减少固定资产投入、提高单位时间生产效率；（2）模块化的操作集成一次性产品使得工艺灵活高效，可多地复制生产，符合不同地区的监管标准。抗体药物行业连续生产的新技术从上游发酵贯穿到下游纯化至原液制备，现阶段已经可以应用在药物研发和生产的连续工艺技术主要包括连续灌流生产、连续细胞澄清、连续流层析、在线病毒灭活、在线浓缩与在线洗滤等。

       【连续灌流培养技术】

       连续灌流培养技术是指接种后新培养基的持续加入，含有产品的培养基持续收获，细胞截留装置将细胞保留在反应器中。相对于批次培养，灌流培养从根本上解决营养物耗竭和代谢副产物积累之间的矛盾，极大地提高培养过程中的细胞密度、延长培养周期，提高目的产品产量。凝血因子VIII是第一个获得批准的采用灌注工艺生产的生物药物，生产周期达到185天，细胞密度和凝血因子VIII产能与批式培养相比可提高30倍。按上述结果计算一个100-500L的反应器就可达到批式培养3000-15000L反应器的生产能力，大大降低了对工厂规模的要求，Clincke等在10 L的WAVE反应器中通过使用ATF截留系统培养CHO细胞，细胞密度达到了2.14×108cells/ml，经过12天的培养，抗体浓度达到了3g/L。

       连续灌流培养技术是一个复杂的体系，很多条件共同起作用，从而改善细胞培养效果，如合适的培养基、灌流策略以及截留方式等，其中生物反应器内的细胞截留方式也是一个需要考虑的重要环节。当新鲜培养基持续补充的同时，含有代谢产物的旧培养基也需要不断地从反应器内移出，以保证培养体积和环境稳定。同时，在细胞密度不断增加时，需要相应地提高灌流速率来满足细胞对营养物质的快速消耗，普通的截留装置在高流速、粘度的料液中极易发生堵塞，造成培养无法正常继续下去。目前应用较多的分离技术有Wave Lily pad截留膜技术、中空纤维（ Hollow Fiber）技术、连续流离心机技术及超声细胞分离技术。

       图2 连续灌流培养示意图

       通过连续灌流培养技术延长培养时间，可获得更高的细胞密度，增加蛋白表达量，同时目的产物在生物反应器更短的滞留时间有利于维持产物的质量。在实际生产应用中，灌流工艺可以减小设备的尺寸和提高单位体积的产率，可将上游生产和下游纯化整合到一起，更有利于一次性技术平台的搭建，从而降低相应的设备及厂房固定资产投入。

       【连续细胞培养液澄清】

       连续细胞培养液澄清是连续生产工艺中的关键步骤，目前主要的手段有连续流离心、切向流膜过滤和基于声波原理的分离方法。

       连续流离心能够有效的去除细胞和大细胞碎片，但是在离心过程中细胞可能会被破坏，在离心中许多亚微米大小的颗粒不能被去除，这样就增加了后续的深度过滤的负担。

       膜过滤技术一直被广泛应用于固液分离，但是膜堵塞一直是这项技术中一直存在的难点。切向流膜过滤技术通过引入切向的冲刷作用，实现了料液的长时间循环，从而被广泛运用于灌流工艺中。

       基于声学分离原理，细胞培养液的澄清实现了一种全新的可放大的一次性技术，这种技术是使用低频声波产生一个贯穿流道的3D声波，当细胞进入带有串联的带有声波发生器的腔室，细胞及细胞碎片被声波作用捕获，然后细胞迁徙到驻波节点，并开始聚集在一起，最后聚集细胞由于浮力降低，在重力作用下从悬浮液中沉降下来，设备所滤出的物料即为澄清后的细胞培养液。这种声学原理澄清方式的产出物质量和离心方案相同，但解决了离心方案中占地空间需求高及清洁验证复杂的问题。同时，从声学分离器滤出的浊度下降的同时也减少了二级澄清所需深层滤板及后续生物负载控制过滤的过滤面积需求。

       【连续流层析技术】

       传统的下游纯化是以批次方式进行，产品的结合、洗脱等纯化操作都是在单一层析柱中完成。填装后的柱床为避免产品过载，层析介质的利用率仅为其静态载量的50-70%。为适应上游表达量的提升，通常会选择单柱多循环层析。

       应对上游灌流连续生产和批次生产日益提高的表达量，下游的纯化方式也从批次向连续纯化转变。连续流层析技术是使用一系列互相连接且显著变小的层析柱，在短的接触时间内，以过载上样的方式进行样品纯化的生产方式。层析柱在上样与非上样过程之间切换，每个上样过程包含两根层析柱，以保证前上样柱在达到一定的样品流穿水平后及上样后冲洗过程中，流穿样品完全被后根层析柱吸附，非上样层析柱同时执行洗脱、清洗、及平衡过程。上样与非上样步骤的同时进行可大幅缩短工艺时间，缩小设备规模并较少缓冲液用量。同时，连续层析过载上样能提高介质的利用效率，小规模层析柱短的接触时间能显著提高生产效率（g/l/hr），更小的操作单元集成一次性技术使得连续层析技术有极高的灵活性，与传统批处理相比，它可提高介质使用率40-60%；此外还可使产量提高2倍。另一方面，由于连续流层析技术可以更快的纯化出活性大分子，该项技术也被应用于纯化相对不稳定的蛋白，例如酶类或者重组凝血因子类蛋白。连续层析技术适用于不同的分离方式，在抗体纯化领域，已有供应商提供多柱位连续流层析产品，如GE ?KTA pcc75可在同一台设备上同时进行阴、阳离子两步层析操作，使得抗体产品下游纯化实现全过程的连续生产。

       当然，连续流层析技术的应用还面临工艺上的几个难点：第一，如何自动化控制以满足整个生产周期中不稳定的上游料液变化；第二，如何保证层析填料能够在整个生产周期中保持稳定的分离效果；第三，如何有效实现无菌工艺。目前，生物制药行业已有药品生产企业应用连续层析技术生产的药品进行临床申报，赛诺菲也在研究该技术在**领域中的应用。

       【在线浓缩技术】

       在线浓缩技术又称为单向切向流过滤技术，特殊设计的膜包流路使得料液单向通过膜材可浓缩4-6倍。该连续生产工艺的突出优势在于节省了每个单元操作间的大体积存储容器，减少了系统的死体积并提高了产品的回收率，最终节省了占地空间。在线浓缩装置在连续生产过程中可用于细胞液澄清后的浓缩，减少层析上样量，提高连续流层析单位时间产率，较批次生产效率提高5倍以上。在线浓缩装置在连续生产过程中还可用于最后原液产品的制备，2套在线浓缩装置串联使用，可达到40倍的连续浓缩效果。

       连续生产技术有多种实现方式，主要分为：（1）上游到下游的全连续生产模式，每一个单元间药液持续运行；（2）端到端的连续生产模式，进料和出料是连续生产，中间操作单元可以是批次方式。（3）杂合的连续生产模式，部分生产工艺为连续，其他部分为批次形式。目前，全连续生产所需的在线稀释、在线病毒灭活、在线洗滤等技术也在持续研发中，相信不久的将来将会实现完整的抗体药物全连续生产。

       作者简介：张功臣，制药行业专家，主要从事制药用水系统、无菌与生物工艺系统的研究与实践。全国大学生制药工程设计竞赛委员会专家，国际制药工程协会（ISPE）培训专家，国家药品监督管理局检查员培训专家，中国药典通则0261制药用水课题组专家，国家标准《GB50913-2013 医药工艺用水系统设计规范》编委。