双特异性抗体的构型有许多种。一些研究表明，针对某些特定的抗原，某种构型可能表现更佳。但通常意义上说，一种结构是不足以满足所有需求的。这是因为单克隆抗体的互动、抗原上的表位位置、以及抗原在靶向细胞表面的密度与运动性，都会影响到T细胞的激活。

       在诸多双特异性抗体中，许多研究人员对双特异性T细胞接头（BiTEs）有独特的兴趣。这是一类重组的双特异性蛋白，具有两个相连的单链可变片段，其中一个靶向T细胞表面的分子（如CD3ε），另一个靶向癌细胞表面的抗原。这两种单链可变片段被灵活地连接在一起。

       2014年，美国FDA批准了能够针对CD19的BiTE分子Blincyto®（blinatumomab），用于费城染色体阴性的复发或难治性B细胞前体急性淋巴性白血病（ALL）的治疗。Blinatumomab由VL-VH向的抗CD19单链可变片段，与VH-VL向的抗CD3单链可变片段，通过G4S连接。由于分子体积较小，这些BiTE的半衰期只有1.25小时。为了克服这一限制，人们正在研究一些新的方法，譬如将BiTE连接到重链片段，或是做出其他新的设计，以提高它在血清里的半衰期。此外，它也能通过连续的输注治疗，确保体内的浓度。

       最近，行业对BiTE的体内制造产生了兴趣。其一大策略是通过基因改造的T细胞来产生BiTE，这能克服其半衰期较短的问题。另一种方法是使用溶瘤病毒来表达BiTE。与此同时，研究人员们也指出了BiTE的一大挑战：它的活性取决于肿瘤部位的T细胞种类和密度。倘若这些T细胞都已经耗竭，或都是调节性T细胞，就会影响到BiTE的效果。

       另一种双特异性抗体——双链抗体（diabody）是由两条链组成的双价分子，每一条链都具有VH和VL结构域。在双链抗体中，两个可变结构域通过较短的连接子（如G4S）相连。也正是由于这些连接序列较短，双链抗体无法通过链内重组形成抗原结合位点。相反，这两条链会以“头-尾”的方向形成双聚体，成为一个紧实的分子。如果在同一个细胞内同时表达这两条链，就有望产生双特异性的异体双聚体，带来相应的可变域（VHA-VLB / VHB-VLA，或VLA-VHB / VLB-VHA）。但此类双链抗体的一个潜在问题在于，如果形成同源双聚体，则无法带来正确的可变域（VHA / VLB或VHB / VLA）。一个替代做法是在这两条链的C端上，将半胱氨酸共价链接，即双亲性重靶向蛋白（dual-affinity retargeting proteins, DART）。

       作用机制中的关键

       T细胞的亚群：在CAR-T细胞疗法中，CD4阳性和CD8阳性的T细胞经常被混在一起进行基因编辑，插入CAR，再被输注回患者体内。尽管CD8阳性的T细胞被认为是杀伤癌细胞的主力军，但CD4阳性的T细胞在装备了CAR之后，同样能被激活，并显示出细胞裂解的活性。同样，在与BiTE分子共同培育时，CD8和CD4阳性的T细胞也都能被激活，诱导靶向肿瘤细胞的死亡。其中的区别在于CD8阳性的T细胞杀伤速度更快。

       T细胞的表型：现在我们知道，分化水平越低的CAR-T细胞，在体内的疗效越好。因此，研究人员们期望能尽量产生TSCM（stem memory T cell）与TCM（central memory T cell），并对其保持维持。但在BiTE领域，我们需要不同的T细胞类型。初始T细胞在BiTE的作用下，无法被激活。因此， BiTE介导的细胞**，需要和共刺激信号通路无关的T细胞群体参与。

       连接的结构域：由BiTE与CAR介导的T细胞-靶向细胞的结合在形式上有所不同。这可能是因为BiTE涉及到了天然的CD3复合体。对于BiTE来说，肿瘤相关抗原表位与靶向细胞膜之间的距离，决定了它的活性。这可能是不同双特异性抗体疗效产生差异的原因。

       T细胞的扩增：CAR-T细胞在扩增后，可达到体内循环淋巴细胞的20%之多。而对于BiTE来说，大量曾接触过抗原的T细胞能直接加以利用，从而减少了对于细胞扩增的依赖。相比CAR-T细胞动辄扩增1000倍以上，在一些BiTE案例中，T细胞只需扩增2-4倍。这一特性有望让BiTE在实体肿瘤的治疗上更具优势。当然，这需要建立在对实体瘤进行良好穿透的前提下。

       亲和性：最初，人们认为较低的CD3亲和性（KD ～ 10 ^ -7M或以上）能避免非特异性的T细胞激活。这是因为高亲和性（KD ～ 10 ^ -9M - 10 ^ -8M或以下）的二价CD3结合可能会带来非靶向特异的T细胞激活。但后续的研究则表明这些非特异的激活可能与抗体的交联有关，而非二价结合的直接后果。

       T细胞疗法的未来

       作者在文章中指出，在T细胞疗法领域，未来主要的几大策略包括：

       通过提供积极的刺激，或是对免疫检查点进行抑制，增强临床上的抗肿瘤效果

       寻找到创新的靶点，以克服实体肿瘤微环境导致的耐受，或是克服恶性血液癌症中由于抗原表达下调而导致的获得性耐受

       寻找到T细胞的新来源，如异体的通用型T细胞疗法

       精准地调控效应细胞，以限制疗法的**

       先进的CAR工程化技术有望能拓展CAR的结合能力，让其靶向多种不同的抗原。如果CAR-T细胞能结合两种抗原，并只有在同时结合的情况下才被激活，则有望为这一疗法带来革新。作者指出，这些细胞能先通过第一代CAR技术结合第一种抗原，产生第一个信号。接着，通过设计一款嵌合的共刺激CAR（只在没有CD3ζ的情况下发生共刺激），第二款抗原能产生第二个信号。在实体瘤领域，类似的肿瘤相关抗原的“双靶向”策略有望增强T细胞的选择性，拓展应用前景。为了确保这种方法能取得成功，我们必须对肿瘤相关抗原进行仔细的选择，确保它们在细胞表面存在或表达。

       最近的一些新型CAR设计保留了CAR的骨架，但使用了单链可变片段之外的结构域。比如有些公司使用的是CD16的细胞外结构域，一些公司开发的T细胞表达有自然杀手细胞的受体（NKG2D），以靶向8种不同的肿瘤配体。

       另一些公司正在尝试使用不同的T细胞。比如bluebird bio和苏格兰的生物技术公司TC Biopharm合作，利用gamma delta T细胞，开发针对实体瘤的CAR-T疗法。按设想，这种疗法能选择性地靶向癌细胞，而不会攻击健康细胞，从而显著降低**。

       还有一类新颖的设计是使用药物分子去激活CAR。在这类设计中，CAR的信号元件被分成了几大块。只有在某种药物存在的前提下，它们才会聚集在一起产生信号。由Cellectis授权给Servier与辉瑞（Pfizer）的UCART19就具有类似的开关。只有在rapamycin存在的情况下，CAR-T才会被激活。Bellicum Pharmaceuticals的GoCAR-T疗法同样应用了类似的技术，激活它的药物是rimiducid。