手足口病（hand, foot, and mouth disease，HFMD）是一种常见的儿童传染性疾病，其特征表现为发热，口腔后部多发溃疡及手、足底、臀部丘疹或疱疹，部分危重患儿可出现无菌性脑膜炎、急性弛缓性瘫痪、脑干脑炎、肺水肿、心肺衰竭等严重并发症。HFMD具有高度传染性，可通过粪-口途径、直接接触、间接接触及呼吸道飞沫等途径进行传播。目前，临床上防治 EV71 感染缺乏特异、高效的药物，常以对症治疗为主。所以，研发稳定、有效的抗肠道病毒71型**显得至关重要。
目前，在研的EV-A 71**包括灭活全病毒**、减毒活**、病毒样颗粒**、重组VP 1蛋白**和合成多肽**。但是，仅有灭活的EV-A 71全病毒**完成Ⅲ期临床试验并已广泛应用。
1、灭活全病毒**
灭活全病毒**是利用理化方法处理人工大量培养的完整病毒，使其丧失感染性和**而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的**。迄今为止，中国大陆、中国台湾、新加坡已开发了完整的灭活全病毒EV-A71**。
科兴生物技术有限公司（Sinovac）、微谷生物技术有限公司（Vigoo）和中国医学科学院医学生物学研究所（CAMS）于2010年至2011年完成灭活全病毒EV-A71**的Ⅰ期临床试验，2013年完成Ⅲ期临床试验，并于2015年获得我国食品药品监督管理局的批准正式投入使用。这三个单位使用不同的病毒株开发**，分别为：H07菌株、FY 7 VP 5菌株、FY- 23菌株，均属于EV-A71 C 4亚型，是我国最常见的EV-71 A亚型。CAMS使用KMB-17人类二倍体细胞作为细胞库，使用细胞工厂扩增EV-A71病毒，Vigoo和Sinovac使用Vero细胞作为细胞库分别通过微载体生物反应器和细胞工厂扩增EV-A71病毒。三个单位均使用甲醛灭活EV-A71病毒，并添加铝明矾佐剂来制备EV-A71灭活全病毒**。
中国台湾研制的灭活 EV-A 71 全病毒**采用 EV-A71 临床分离株E59 菌株（B4亚型）。于2019年启动Ⅲ期临床试验（ClinicalTrials.gov，编号NCT03865238），预计将于2022年完成。新加坡使用B 3亚型，已完成Ⅰ期临床研究。研究表明，灭活EV-A71全病毒**具有良好的保护性和安全性，但仅能预防部分EV-A71感染，仍需进行进一步研究。
2、减毒活**
减毒活**是通过将微生物的自然强毒株通过物理、化学或生物学等方法进行处理而制成的**，减毒活**丧失致病力或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性。研究者参照脊髓灰质炎病毒减毒的策略对EV-A71 BrCr 株基因组 5'非编码区、3D基因和 3'非编码区进行变异，得到EV-A71减毒株（S1-3'）。接种了EV-A71（S1-3'）的食蟹猴可在致死剂量的EV-A71攻击下存活，产生针对 EV-A71不同基因型（A、B1、B4、C2和C4型）的中和抗体，但部分猴子接种**后出现震颤，并在脊髓中分离出减毒病毒。
研究表明，EV-A71减毒活**是可行的，但应该进一步改善**的安全性。近年来出现了一种使用密码子去优化病毒制备减毒**的方法，研究者将病毒特定氨基酸对应优选密码子替换为与之对应的最不优选密码子，使其双核苷酸CpG和UpA水平升高，从而降低病毒的毒力及生存能力。研究显示，通过对病毒3D RNA聚合酶的L123 F和G 64 R两处氨基酸位点进行修饰，构建高保真的 EV-A71 减毒株，接种该减毒株小鼠产生针对EV-A71的特异性中和抗体且未产生体质量减轻、瘫痪、死亡等严重不良反应。提示该减毒株具有较高的免疫原性及较低的毒力。密码子去优化是一种开发安全稳定的减毒**的新方法。
3、病毒样颗粒**
病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，在形态特征和抗原性上与天然病毒颗粒相似，具备激发宿主免疫反应的能力。VLP不含病毒基因组，不能自发复制感染，是构建候选**的安全之选。
基于制备脊髓灰质炎病毒VLP**的经验，可构建昆虫细胞-杆状病毒表达系统，制备EV-A71B5亚型VLP**。该**能诱导恒河猴产生高水平的针对EV-A71不同亚型（B4、B5、C2和C4亚基因型）的特异性抗EV-A71病毒IgG和IgM，阻止EV-A71在恒河猴中传播。除杆状病毒表达系统外，EV-A71 VLP 还可以在酵母中产生，使用毕赤酵母表达 EV-A71 VLP，能有效诱导小鼠产生针对同源和异源EV-A71株的中和抗体，还能通过母体免疫保护新生小鼠免于EV-A71攻击。EV-A71 VLP**具有良好的保护效果，具较高安全性且易于制备，是优质的EV-A71候选**，但VLP**的生产成本较高，产量较低。
4、重组VP1蛋白**
病原体引起免疫反应的主要成分是抗原蛋白上的抗原决定簇，抗原决定簇是由数量不等的抗原表位组成。EV-A71的主要抗原表位大多位于VP 1蛋白。将重组杆状病毒Bac-Pie1-gp64-VP1转入昆虫细胞后成功表达了C 4亚基因EV-A71的VP1，这种VP1蛋白与原始病毒VP1蛋白具有相同的形态结构及免疫原性。小鼠接种这种重组蛋白后能产生高滴度的针对EV-A71病毒所有基因亚型的中和抗体。研究显示，通过基因重组技术获得包含gag蛋白（人免疫缺陷病毒结构性多蛋白Pr 55 gag的前体蛋白）和EV-A71 VP 1 蛋白的VLP（gag-VP1 VLP）。这种**能诱导小鼠产生强烈的体液和细胞免疫反应，还能通过母体免疫保护新生小鼠免受致命剂量EV-A71的攻击。以上研究表明，重组VP1蛋白**能同时诱导体液和细胞免疫应答，并能对不同亚基因型的EV-A71产生交叉中和作用，具有较好的发展前景。但VP1蛋白**的保护作用仍需进一步强化。
5、合成肽**
合成肽**是根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的一类**。这种**通过人工合成病原微生物的保护性多肽或抗原表位，并辅以适当的载体与佐剂而制成的一种新型基因工程**。
EV-A71 病毒上的多肽SP70位于VP 1 蛋白，是EV-A71的主要中和表位的重要组成之一。研究显示，利用B4亚基因型EV-A71 的SP70免疫小鼠，小鼠可产生同原病毒免疫相似效价的特异性IgG，且能对B2、B5、C2、C4亚基因型病毒产生交叉免疫反应。抗SP70血清能对同源及异源EV-A 71（B2、B4、B5、C2、C4）的攻击提供较强的保护作用。研究发现，CV-A 16抗原表位PEP 71能诱导小鼠产生针对同源和异源 CV-A 16 菌株的中和抗体；且CV-A 16 的SP70肽的氨基酸排列与PEP 71高度重叠，提示SP 70可能同样具有开发通用CV-A 16**的潜力。基于此研究，将EV-A71 VLP中的SP70肽替换为CV-A16 的SP 70 肽，设计一个嵌合的EV-A71 VLP（ChiEV-A 71 VLP）。这种**能诱导小鼠产生针对EV-A71和CV-A16的特异性体液免疫，还能诱导小鼠脾细胞IFN-c，IL-2，IL-4和IL-6显著升高，激活小鼠针对EV-A71的有效细胞免疫应答；小鼠注射抗ChiEV-A71血清后可在致死量的EV-A71和 CV-A16攻击下存活。研究提示，抗ChiEV-A71血清能同时具有针对EV-A71和CV-A16感染的保护作用。合成肽**具有较高的特异性、较好的免疫原性和保护性。通过研究不同抗原肽的保护作用，并选择不同抗原肽嵌合肠道病毒VLP制备**的方法可能是制备多价HFMD**的新思路。
EV-A 71 是最 具致病性的肠道病毒之一，虽然我国研发的EV-A 71灭活**已批准上市，但该**仍需进行进一步的远期评估。同时也要继续深入研究减毒活**，病毒样颗粒**、重组VP1蛋白**、合成多肽**等新型**，需在保证**安全性的前提下，进一步提高其保护效力及生产能力。同时，除EV-A71以外，CV-A16和近年来新兴的肠道病毒如CV-A6、CV-A8和CV-A10等也与HFMD的暴发有关。因此研制预防多种肠道病毒感染的联合**将是预防HFMD**的重要研究方向。
参考资料
[1]毕方川,许红梅.肠道病毒71型**研究进展[J].临床儿科杂志,2021,39(05):391-395.
[2]汤华萍.国产肠道病毒71型**上市后免疫效果、安全性、接种意愿及其免疫策略研究进展[J].中国实用医药,2021,16(23):201-203.
作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证
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