A型多糖结合**生产与质量控制

       多糖化学连接蛋白时，多糖需要活化即化学修饰。当前主要的两种多糖活化方法是高碘酸盐氧化和氰基化作用。高碘酸钠氧化二元醇（两个相邻的碳带有羟基）成为醛（C=O），同时断裂C-C键，使多糖糖环打开。对A型多糖而言，只有缺乏O-乙酰基的重复的3号碳可以被高碘酸钠氧化，这样可以起到保护A型多糖结合**。O-乙酰基占纯化A型多糖的77%-85%，可以起到保护免疫原性的作用。

       对于大部分结合产物，在氰基硼氢化钠存在下，活化的多糖的醛基会和蛋白的氨基结合形成稳定的仲胺。多糖醛基与赖氨酸 ε-氨基的结合是一个缓慢的过程，经常仅能获得较低的产率。新的方法被发明出来降低结合时间，提高结合产率。结合效率通过同时活化多糖和蛋白载体蛋白方法提高活化的A型多糖与破伤风类毒素（TT）或酰肼活化的破伤风类毒素（TT-H）在室温条件下反应过夜（15-16小时）。相比于TT，多糖与TT-H结合可以获得更高分子量的结合物。

       A型多糖-破伤风结合**被分装成1-2mg、25mg、500mg规格，用于验证结合方法的重复性和可测量性。如图1，在酸性条件下，1-乙基-3（二甲氨基丙基）碳二亚胺条件下，TT的羧基被酰肼替代。A型多糖在无O-乙酰基的多糖处C3-C4被高碘酸钠部分氧化（图1）。TT活度显示每个TT分子50个酰肼基团，而活化的A型多糖100个重复单位/每醛基。使用高效凝胶过滤色谱分离，206nm波长检测未活化、活化后的TT和多糖及多糖-TT结合物。显示活化后的TT分子量大小与未活化前相当，保留时间在22 min，表明较少聚合产生（图2）。活化后的多糖分子量变小，显示部分降解。结合反应之后一个高分子量的峰出现，表明A型多糖-TT结合物产生（图2）。使用TT-H相较于TT，会产生较多结合产物。理化分析在生产过程中的各个环节进行，并存在多种可选方案。Silveira等在研究使用TT-H法生产的C型脑膜炎多糖结合物时，使用核磁共振显示在结合后，活化多糖醛基的消失。同时，也描述了用于表征脑膜炎球菌多糖结合物的物化方法，其中包括肼含量的测定。由于多糖上的多元醛结构和TT上多元酰肼结构，结合方法会产生高分子量的交联结构。该方法还被用于C、W型多糖的结合，可实现50%的结合物产率。

       （图1） （图2）

       动物体A型多糖结合物免疫研究

       A型多糖-TT结合物通过S-400分子排阻色谱分离高分子量和低分子量的结合物。通过S-400分离柱，将结合物分离成4部分（16-20，21-25，26-30，31-35）去研究它们对小鼠的免疫原性。在注射小鼠3×1-μg多糖时，相较于游离多糖（≥为检测结合物的质量和效能，研究了MA031221J在低剂量条件（0.1-μg多糖剂量）下的免疫原性和添加-400%多糖或TT的影响（图4）。第一次注射2周后，天然多糖和0.1-μg的多糖结合物仅引起较少的抗体（≤200units/mL），而1-μg可以产生显著的抗体水平（≥1000-3000units/mL）。在第二次或第三次接种后，天然多糖可表现免疫原性（≤1000units/mL），而0.1-μg和1-μg结合物可引起较高水平抗体（≥220000units/mL）。多糖或TT的存在(-400%)对0.1-μg和1-μg结合物剂量有较小影响。

       在I期人体临床实验前，多种GMP标准下，不同生产规模的A型多糖结合**在小鼠或兔子进行安全性和免疫原性研究。

       （图3） （图4）

       A型多糖-TT结合**

       A型多糖-TT结合**冻干保存，使用前溶解，肌肉注射。**溶解于包含0.01%硫柳汞和0.3 mg三价铝离子（以磷酸铝记）盐溶液中，0.5-mL/剂，包含10μg A型多糖结合10-33μg TT，0.06 mg Trs。最近在免疫扩张项目，5-μg规格的**被WHO提前授权用于婴幼儿免疫。

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