3.结果与讨论

       N-连接糖蛋白的两种岩藻糖基化结构，核心-和天线-岩藻糖基化，已被认为是各种癌症中的生物标志物[1]。通常很难区分这两种结构。因此，我们试图开发一种方法来区分目标蛋白的每个糖基化位点上的核心-和天线-岩藻糖基化。本研究的工作流程如图1所示。简而言之，将血清蛋白α-1抗胰蛋白酶（A1AT）标准品消化成肽段，然后通过唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化处理用于糖基的切除。将处理后的糖肽半富集并通过3K滤膜脱盐后直接通过LC-MS/MS进行分析。因此A1AT的核心-和天线-岩藻糖基化被成功地区分和定量。

       血清蛋白的总体岩藻糖基化水平相当低[26]。利用用于肽分析的常规质谱设置，将发生糖肽的源内碰撞诱导的解离（也称为喷雾分离器解离，在此缩写为源内解离）。这是离子从大气压离子源转移到质谱仪的真空室期间由于碰撞激发而导致解离的过程[27]。在我们的实验中，发现糖肽的源内解离严重影响低丰度岩藻糖基化肽段的鉴定和半定量。但是，迄今为止还没有对这个问题进行详细分析。以A1AT糖肽中最丰富的糖基修饰类型A2为例，A2在唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后应含有3个Hex（甘露糖），4个HexNAc（N-乙酰葡糖胺），0个NeuAc，0个NeuGlc和0个dHex，在这里简写为34000。如图2所示，使用赛默飞开发的Orbitrap Fusion质谱仪（离子传输管温度=300℃，RF=30%）[28]，通过“常规”方法设定或更严格的设定进行肽段分析发现超过20%的34000糖链被衰减到23000（以XIC23000 / XIC34000计算）。因此优化了用于糖肽分析的一系列MS设定。我们发现在较低温度和较低的RF（150℃，20%）条件下，糖肽的源内解离降低到3%以下，而含有34001糖链的核心-岩藻糖基化肽段的信号没有显著降低。我们还发现，较高的喷雾电压（喷雾电压> 2300 V）会提供更高的信号，但同时也增加了源内解离。因此使用稳定喷雾的喷雾电压2300 V。该优化的设定条件用于进一步鉴定A1AT糖肽的位点特异性糖基化以及对核心-和天线-岩藻糖基化进行半定量。

       图3显示了直接的LC-MS/MS策略，首先通过用低能HCD MS2检测氧鎓离子138.05来选择糖肽（图3A）；然后将来自糖肽片段的Y1离子进行高能量HCD MS3（图3B）用于肽段测序；而所选择的糖肽进行CID MS2（图3C）用于糖链的结构分析；图3D中总结了整个流程。第一步的HCD碰撞能量（CE）对糖肽的片段化至关重要。它针对提高氧鎓离子的检测和Y1离子的选择进行了优化。如图4所示，对于含有Asn271位点的非岩藻糖基化以及核心-岩藻糖基化或天线-岩藻糖基化的二天线糖肽，当CE为24（从CE20到CE32的一系列HCD中）时的低能量HCD MS2提供了最强的Y1离子片段。这种最适的CE似乎与糖链结构或肽段序列无关。如糖肽（含有Asn271位点）所示，无论是非岩藻糖基化还是核心-岩藻糖基化或天线-岩藻糖基化结构都具有相同的最适CE（图4），其中AlAT的其他2种糖肽（含有Asn107或Asn70位点）也具有相同的最适CE（补充信息-图S1）。

       与此相反，第二步用于肽注释的HCD CE和第三步用于糖链注释的CID CE灵敏度却不高。当CE为35、38或40时，HCD MS3均显示出相似的裂解模式（如图5所示），其中HCD MS3 CE35对较高m/z的片段产生的信号稍强。糖肽的糖链结构在CID CE30和CE35下均显示出相似的裂解模式（图6）。因此在随后的实验中，分别使用低能量HCD CE24，CID CE30和高能量HCD CE 35。

       唾液酸酶释放α 2-3,6,8,9-N-乙酰神经氨酸，导致N-糖链的末端变为半乳糖。随后，β-半乳糖苷酶切除β 1-3,4半乳糖，前提是没有岩藻糖与N-糖链末端N-乙酰葡糖胺结合，因此提供了区分核心-岩藻糖基化和天线-岩藻糖基化的方法[19]。在唾液酸酶消化的样品中核心-岩藻糖基化和天线-岩藻糖基化糖肽具有相同的m/z（图7.B），因此唾液酸酶消化样品的图谱是核心-和天线-岩藻糖基化肽段的混合物（图7.B1）。相比之下，唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化的样品中核心-和天线-岩藻糖基化肽段具有不同的m/z（图7.A）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶对糖肽进行双重消化后，不需要进一步的MS/MS分析或大量连续的外切糖苷酶消化就可以区分出两种类型的岩藻糖基化，这与之前在糖链水平上的工作相似[19]。此外，用唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后，天线-岩藻糖基化糖肽的保留时间早于其相应的核心-岩藻糖基化糖肽（图7.A），表明半乳糖增强了其亲水性。我们发现核心-和天线-岩藻糖基化糖肽的洗脱时间和裂解模式都不相同。在核心-岩藻糖基化糖肽的CID MS/MS图谱中，可以观察到几个核心-岩藻糖基化糖肽片段（图7.A1）；而在天线-岩藻糖基化糖肽的CID MS/MS图谱中出现的三个信号最强的片段为pep-43001，pep-43000和pep-33001（图7.A2）。其他糖肽中也发现了核心-和天线-岩藻糖基化裂解模式的差异（图S2）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后，可以通过直接LC-MS/MS分析获得核心-和天线-岩藻糖基化肽段之间的稳定差异。传统的外切糖苷酶与岩藻糖苷酶α 1-2,3,4,6和岩藻糖苷酶α 1-3,4也可以进一步应用于唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化的糖肽，显示了该策略的有效性（图S3）。

       在之前的研究中，我们分析了从糖蛋白A1AT上释放的糖链，发现A1AT在唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后有12种不同的糖链结构[19]。在本研究中，我们鉴定了10个特定糖基化位点上的这些结构。它们在C18色谱柱上的保留时间及其相对强度如表1所示。在补充信息-图S2中显示了所有鉴定糖肽的低能量HCD MS2，高能量MS3和CID MS2图谱。含有Asn107位点的糖肽1 ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR（修饰的氨基酸显示为小写）具有最多种类的糖链修饰类型，包括A2，FA2，A2FG，A3，FA3，A3FG，A4，FA4，A4FG，A3F2G2，而其他两个位点具有比较少的糖链修饰类型（含有Asn271位点的糖肽2YLGnATAIFFLPDEGK：A2，FA2，A2FG，A3，A3FG和含有Asn70位点的糖肽3 QLAHQSnSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTK：A2）。每个位点的糖基化程度可能取决于蛋白质结构或者位点与某些氨基酸或N/C末端的接近程度[22]。如图8（晶体结构来自[29]）所示，所有三个位点都位于蛋白质表面和环中，其中Asn107几乎位于大环的中心，并且可能更易接近各种糖基转移酶，而Asn271和Asn70更接近α螺旋或β折叠结构并且空间较小。这可能在某些方面解释了为什么Asn107具有最多的糖基化修饰类型。

       正如预期所示，在唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后，核心-岩藻糖基化糖肽额外的岩藻糖使得糖肽更具亲水性，因此其从C18柱的洗脱早于其相应的二天线-和三天线糖链修饰的非岩藻糖基化糖肽。与相应的核心-岩藻糖基化的情况相比，额外的半乳糖使天线-岩藻糖基化的二天线糖肽更加亲水。然而，进一步的半乳糖和/或岩藻糖没有使得三-或四-天线糖肽更加亲水，并且所有岩藻糖基化的三天线糖肽或四天线糖肽在非常缓慢的洗脱梯度（0.2%ACN /min）下洗脱时间相似。这表明在唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化后，糖肽的疏水性主要由其肽骨架决定，只在二天线糖链中发现有轻微的疏水性变化。这种变化可能是由于与三天线-和四天线-糖链相比，二天线糖链具有较少的糖基，因此一个或两个额外的糖基就可以导致糖肽总体疏水性更高。

       我们先前对糖链的研究表明，非岩藻糖基化的二天线-和三天线-糖链是A1AT中最丰富的两个糖链结构，分别占35.8％和25.2％[19]。在糖肽1和糖肽2的研究中，我们发现Asn107上的二天线-和三天线-糖链修饰分别占48％和34％，而在Asn271上分别为97％和1％（表1）。糖肽3的分析显示Asn70上仅有A2糖链修饰；因此我们认为Asn70上的糖链修饰对A1AT蛋白的整体糖基化没有多少贡献。卡方检验用于比较从A1AT蛋白质释放的糖链类型（数据来源于以前的结果[19]）和糖肽1（含有Asn107位点）的糖链修饰类型或糖肽2（含有Asn271位点）的糖链修饰类型（表2）之间的主要糖链修饰类型的相对峰强度。从A1AT蛋白释放的糖链类型与Asn271上的糖链修饰类型显著不同（p值一项经典的凝集素印迹试验研究发现，核心-岩藻糖基化而非天线-岩藻糖基化的A1AT的上调可以作为肝细胞癌诊断的指标[20]，而A1AT的天线-岩藻糖基化可以作为炎症发生的指标，尤其是在HBV感染的患者中[22]。我们先前的糖链研究表明，二天线-核心-岩藻糖基化是A1AT蛋白质中最丰富的核心-岩藻糖基化类型。从表1中我们可以推断，如果患者的A1AT核心-岩藻糖基化类型发生改变，Asn107位点上的二天线-核心-岩藻糖基化很可能是通过质谱法进行精确监测和定量的合适目标。另一种经典的基于凝集素印迹的研究表明，A1AT岩藻糖基化水平的总体升高能够区分肺腺癌与良性病变或其他肺癌亚型[21]。本研究中开发的策略将能够鉴定和定量A1AT特定位点上的核心-和天线-岩藻糖基化。在今后的工作中，这种方法将被用于研究各种癌症发展过程中血清A1AT糖基化的变化。包括特异性位点信息的更精确的岩藻糖基化分析能够提供更高的诊断价值。此外，该策略可应用于各种疾病发展期间其他关键糖蛋白的研究。

       4.结论

       我们已经开发了一条渠道来研究A1AT的糖基化，以确定核心-与天线-岩藻糖基化的存在，而不用从糖肽中分离糖链和肽段。这是在A1AT蛋白质标准品上进行的，该蛋白质经胰蛋白酶酶切，随后进行唾液酸酶/半乳糖苷酶双重消化。除了末端N-乙酰葡糖胺被岩藻糖基化修饰外，半乳糖苷酶可以去除N-糖链中的末端半乳糖残基，从而提供区分核心-岩藻糖基化和天线-岩藻糖基化的手段。糖链的位点和结构可以通过该方法同时鉴定。我们在糖肽QLAHQSnSTNIFFSPVSIATA的Asn70位点上鉴定了1个糖链结构（A2），在糖肽ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR的Asn107位点上鉴定获得10个糖链结构（A2，FA2，A2FG，A3，FA3，A3FG，A4，FA4，A4FG和A3F2G2）以及糖肽YLGnATAIFFLPDEGK的Asn271位点上鉴定获得5个糖链结构（A2，FA2，A2FG，A3和A3FG）。我们相信该方法将广泛用于在各种疾病发展期间对A1AT或其他关键糖蛋白上的核心-和天线-岩藻糖基化进行鉴定和定量。