作为一个医药行业从业者，也许你对PCR再熟悉不过，但是，你可能无法清楚知道Kary Banks Mullis是哪位大神。

       引用自 NobelPrize.org

       因一项技术而非重大的理论发现获得诺贝尔奖，Kary Mullis的PCR技术应该是第1个，估计也不会有第2个出现！

       PCR已经成为医药行业中一个极为普遍的技术，深刻影响了生命科学的发展，虽然技术仅仅出现30年，但是PCR已经被广泛应用于基因测序、分子诊断、遗传学等等！

       事实上，抗体药物同样与PCR技术息息相关，在抗体药物的早期发现中扮演着重要的角色，笔者借此机会分享一些PCR在抗体药物发现中的应用。

       一．PCR是一个极为高效的DNA合成工厂

       虽然在抗体领域从业时间尚短，笔者对科学充满着敬畏，深知一项改变世界的技术或是理论的价值，PCR在抗体药物发现中的作用是十分关键的，与抗体的早期发现、基因工程、基因测序密切关联！

       1. PCR与抗体发现

       从全球首个单抗药物Muromonab上市以来，抗体药物已经被广泛应用于各个疾病领域，几十年来，抗体的发现技术也逐步成熟，这其中杂交瘤技术、噬菌体展示文库、酵母展示文库已成为抗体药物发现的主要技术方法。例如，利用杂交瘤技术发现的各种-ximab，-zumab，利用噬菌体展示文库发现的阿达木单抗，利用酵母展示文库发现的信迪利单抗。

       1.1 PCR与杂交瘤技术

       杂交瘤技术是一个极为经典的抗体发现方式，当然现在用于免疫的动物已经从小鼠扩大到人源化小鼠、全人源小鼠、羊驼等。

       PCR在杂交瘤技术的用处主要在于免疫抗原的分子构建，一般技术人员会让基因合成公司合成特定抗原序列，然后，再将其构建至in-house的表达载体。

       这是再熟悉不过的流程，但是，如果没有PCR，你便会知道这是天方夜谭！

       1.2 PCR与抗体展示文库

       抗体展示文库也是抗体开发历史上的一个巨大突破，这其中噬菌体展示文库更是广泛应用于抗体发现，George P. Smith和Gregory P.Winter是该领域的先驱，而PCR主要用于抗体展示文库的构建。

       Human-naïve 或 immune 抗体展示文库中，PCR扮演重要角色：

       A. 从动物免疫细胞或是PBMC中提取tRNA，并利用PCR合成cDNA；

       B. 利用PCR扩增抗体的Vh, Vk/λ；

       C. scFv的分子构建。

       Schematic overview about the panning and screening procedure

       上图参考来源为：《antibody engineering》

       阿达木单抗，全球首个全人员单克隆抗体，便是利用噬菌体展示文库发现的。

       1.3 PCR与抗体人源化和亲和力成熟

       上文提到，杂交瘤技术是抗体发现的经典方法，但是鼠源抗体免疫原性和亲和力是一个很大的问题，为了降低免疫原性，降低ADA，同时提高亲和力，很多利用杂交瘤技术发现的单抗都要经过人源化(humanization)，以上事药物中，凡是通用名-ximab，-zumab结尾的多是这种情况！

       图片源自网络https://www.biologicscorp.com/antibodyengineering.html/#.XVFVCG8zbOQ

       人源化和亲和力成熟是一门大学问！无论是，CDR-grafting，定点突变或是抗体的定向进化，PCR均是在这里充当着基本的技术角色。

       2. PCR与抗体测序

       杂交瘤技术中，多轮亚克隆后，筛选到高亲和力克隆，一定是需要对Vh, Vk/λ测序的，这个过程就是PCR的过程！

       total RNA→cDNA→Vh/Vk PCR→构建至载体→测序

       3. PCR与双特异性抗体

       双特异性抗体不同于单克隆抗体，双抗面临许多工艺问题，尽量提高目标双抗的产量，同样尽量降低非目标双抗的含量，这是双抗的终极目的。

       但是，远非这么简单，双抗的format是多种多样的，有的看起来还极富想象力，有的很美，有的很丑，充满脑洞，各种各样format的分子构建都要依赖PCR技术，例如，安进的BiTE, 罗氏的crossmab和knob-into-hole等等！

       PCR在抗体药物中的应用绝不止以上几个方面，细胞株的传代稳定性、细胞株构建、常规的分子构建和蛋白表达等，各种的花式PCR技术，巢式PCR，多重PCR，qPCR，荧光PCR，real-time PCR等等，充满着想象力！

       二．漫谈Kary Mullis

       PCR改变了世界，Kary Mullis的PCR技术也是站在伟人的肩膀上的一项发明！笔者看来，PCR技术得以出现，它是建立在多个诺贝奖级别的关键突破上：

       1. DNA双螺旋结构的解析，Waston、Crick和Wilkins做出重要贡献，诺贝尔奖1；

       2. 1957年，Arthur Kornberg发现第一种DNA聚合酶，开始正确认识DNA复制的分子过程，诺贝尔奖2；

       3. H.Gobind Khorana破解了所有密码子，开创了许多寡核苷酸的合成技术，诺贝尔奖3；

       4. Khorana和他的学生Kleppe 发表一篇具有里程碑意义的文章Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases[1]，这被广泛认为是PCR雏形；

       5. 1976年，Jhon Trela和钱嘉韵成功从Thermus aquaticus内提取到了能够耐75℃以上高温的TaqDNA聚合酶[2][3]，这是极为重要的一个进展；

       6. 1987年，Kary Mullis关于PCR 的关键技术论文发表在Methods in Enzymology

       7. 1993年Kary Mullis获诺贝尔奖

       正是上面1，2，3，5的关键理论和技术突破给PCR的出现奠定了良好的基础，Kary Mullis是一个被选中的天才。

       从其自传中，我们能够对Kary Mullis有一个较为浅显的认识，严重拖延症、幻想症、磕药，笔者不对其三观和行为持任何观点，但是毫无疑问，他首先是一个天才，对，作为一个科学家，Kary Mullis科学知识扎实、思维活跃、极富想象力和洞察力，这是非常难得的科学品质！

       参考来源：

       1. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases." J. Molec. Biol. vol. 56, pp. 341-61 (1971).

       2. Brock TD, Freeze H "Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile" J. Bacteriol. vol. 98(1) pp. 289-297 (1969).

       3. Chien A, Edgar DB, Trela JM "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus" J. Bacteriol. vol. 174 pp. 1550-1557 (1976).

       4. Mullis KB and Faloona FA "Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction." Methods in Enzymology vol. 155(F) pp. 335-50 (1987).

       附：the PCR song

       作者简介：1°C，医药行业从业人员，希望自己的专业文字会越来越有温度，医药知识能够服务更多人，打破信息知识的壁垒！