如何提高移植物和移植受者的长期存活率是移植学研究的主题，其中，对于免疫抑制剂的研究占据着重要的地位，而免疫抑制剂一面是其抗排斥反应疗效，另一面则是其不良反应。免疫抑制剂能抑制与免疫反应相关细胞（主要是T细胞和B细胞）的增殖和功能，降低免疫应答。由于各种免疫抑制剂的作用机制不同且其不良反应的程度多与使用剂量有关，因此，针对移植排斥反应发生的不同靶点和关键步骤常采用多种免疫抑制剂联合的方案，这样既可协同增强免疫抑制效果，又可降低各种免疫抑制剂的剂量和不良反应的发生率。

       APC 为抗原提呈细胞；IL为白细胞介素；TCR为T细胞受体；JAK为Janus激酶；PI3K为磷脂酰肌醇-3-激酶；mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；CN为钙调磷酸酶；MAP激酶为有丝分裂原活化蛋白激酶；IKK为核因子-κB激酶抑制剂；NFAT为活化T细胞核因子；AP-1为激活蛋白因子；CKD/cyclins 为周期蛋白依赖激酶；IMPDH为次黄嘌呤核苷酸脱氢酶。

       近十年来，Treg细胞疗法在一系列与移植相关和非移植相关的适应症上进行了临床试验。虽然这些试验都集中在安全性上，但所有试验的一个核心主题是GMP方案在细胞分离、操作、扩增、剂量、特异性和给药后细胞跟踪方面的异质性。目前Treg在标准化方面达成了一些共识，但现实是Treg细胞的新颖性要求进行大量的人体研究和专注于GMP条件的优化和标准化。部分研究更多的想要制造更纯的细胞，这种想法基于供体反应特异性TREG比多克隆TREG能更好的治疗移植效应T细胞反应。在人类中阐明和利用这一机制是很重要的，因为产物纯度和同种异体抗原特异性的程度可能会对治疗效果和输注细胞数量产生影响。肾 脏的一个关键优势是活体供者有更大的后勤保障范围，这就提供了连续获取新鲜供者抗原的途径，从而提供了供者特异性的Treg细胞。

       01、Treg分类

       由于慢性同种异体移植功能障碍和免疫抑制的长期副作用尚未完全解决，移植耐受仍然是器官移植领域的圣杯。在这一点上，外周循环和移植物微环境中调节性T细胞(Treg细胞)的增加被认为是诱导移植物耐受的重要因素。

       人和鼠的多克隆Treg细胞被经典地分为胸腺Treg细胞(tTreg)、外周Treg细胞(pTreg)和诱导型Treg细胞(iTreg)三大类，一些学者通过tTreg细胞上Helios和Neuropilin-1(NRP-1)的高表达来区分tTreg细胞和pTreg细胞。然而，Helios/NRP-1本身不能对人类的tTregs和pTreg细胞进行分类。

       外周循环中Treg细胞的特征是CD4+，高水平的IL-2受体α链(CD25high)，低水平的CD127和细胞内表达叉头盒P3转录因子(FOXP3+)。新的深层免疫表型技术的采用证实了这种表型比最初认为的更具异质性，这些数据因Treg细胞的种类、类型、分化状态和微环境的不同而不同。进一步的区分是通过鉴定趋化因子受体。

       02、目前研究报道的Treg细胞的特别性质

       A:Treg细胞的可塑性

       Treg细胞在炎性微环境中采用Th17样效应细胞表型和功能的可能性是一个关键的安全问题。这是因为Th17细胞在急性和慢性同种异体移植排斥反应患者中升高，因此可能导致这两种情况的恶化。另一种与Treg-Th17相互作用有关的途径是，两者最初都起源于Naive CD4+细胞，但其随后的分化途径分别由微环境中不含IL-6的转化生长因子-β(针对Treg)或与IL-6(针对Th17)的存在所决定。微环境将Treg细胞转化为促进排斥反应的Th17细胞的潜力可能决定了输注Treg细胞的时间点。理论上，Treg细胞治疗可以是主动的(即在患者发生排斥反应之前)，也可以是反应性的(即给予诊断为急性或慢性排斥的患者)。然而，目前尚不清楚Treg细胞能否在已经被Teffs渗透的微环境中诱导耐受。

       B: 旁观者压制效应

       Treg细胞治疗可能会出现一个潜在的问题，因为Treg细胞一旦被激活，就可以以一种非抗原特异性的方式执行它们的抑制功能。这种被称为“旁观者抑制”的效应是在转基因小鼠模型中发现的，在转基因小鼠模型中，抗原特异性的CD4+CD25+T细胞最初需要与TCR介导的互补表位接触才能激活。然而，一旦激活，这些细胞也能够抑制第三方抗原特异性的效应CD4+T细胞。这一效应在同种异体皮肤移植的小鼠体内模型中也得到了证实。如果这一现象确实在我们的患者中重复出现，可能会对调节抗原特异性排斥反应，同时保持对病原体和潜在肿瘤新表位的免疫力产生影响。

       03、TREG代表性试验

       A. TRACT试验

       试验招募9人，细胞分离采用Clinimacs系统，3周扩增过程中采用抗CD3/CD28拮抗剂、IL-2、TGF-β、西罗莫司。最后得到纯度>98% CD4+CD25+和>80% FOXP3+以及相似的去甲基化水平。患者在移植当天和术后第2天接受alemtuzumab治疗，并维持使用MMF和他克莫司(第30天改用西罗莫司)。Treg细胞随后在第60天被输注。在报告的两年中，没有巨细胞病毒或多瘤病毒引起的机会性感染病例，也没有发生排斥反应。这项试验没有报道在接受新肾移植的患者输注多克隆Treg细胞后发生机会性感染或排斥反应的病例。

       B. TASK试验

       相比之下，TASK试验集中在利用多克隆Treg细胞来调节移植肾的亚临床炎症。这是一个重要的研究问题，因为亚临床炎症由于其慢性低级别的性质而没有得到及时的诊断，并可能导致迟发性同种异体移植物功能障碍。

       患者接受体外扩增的自体Treg细胞，平均剂量为320*106个细胞。2周扩增：抗CD3/CD28拮抗剂，IL-2，重氢葡萄糖处理。最终得到纯度>97%CD4+和>93% FOXP3+和<0.37% CD8+的产品。

       试验招募了三名患者，他们在移植后6个月的活组织检查中表现出这种炎症(Banff i-和t-<2)。当患者获得Treg细胞时，他们已经在服用MMF、他克莫司和强的松龙。重要的是，从安全性的角度来看，试验报告说， Treg产品没有直接导致SAE，在一年的随访期内也没有报告感染或移植物功能障碍。然而，当前试验的一个关键限制是，与另外一个试验中超过12个月的检测不到的情况相比，氘信号在3个月内无法检测到。这就否定了这种技术的长期使用。在输注后2周和6个月的肾活检中，还没有发现这些Treg细胞的报道。因此，目前还不清楚脱氢Treg细胞的产物是否能够迁移到移植物中。补充这一事实的是，在输注后2周，没有患者在肾活检组织中显示FOXP3+%的表达增加，只有1例患者在6个月时出现这种情况。此外，尽管这项技术有助于短期追踪，但它并不提供有关活体Treg功能的知识。总而言之，在肾移植中，在输注FACS分离和多克隆扩增的德化Treg细胞后，没有出现SAE。TASK试验目前正在比较多克隆和同种异体抗原特异性Treg细胞的疗效(NCT02711826)。

       C. ONE试验（德国）

       ONE试验是评估肾移植后通过输注自体自然调节T细胞(nTreg)来重塑患者的免疫平衡是否安全、可行，并使终生大剂量免疫抑制(其疗效有限、不良反应、高直接和间接成本)逐渐减少，同时在有用的概念验证疾病模型中解决nTreg治疗的几个关键挑战，例如简单可靠的制造、过度免疫抑制的危险、与标准护理药物的相互作用以及炎症环境中的功能稳定性。

       参与者：活体供肾移植受者(ONEnTreg13，n=11)和相应的参照组试验(ONErgt11-CHA，n=9)。

       干预方式：CD4+CD25+FoxP3+nTreg产品在肾移植后7天静脉注射0.5、1.0或2.5-3.0×106细胞/kg体重，随后逐步减少三重免疫抑制至小剂量他克莫司单药治疗，直至48周。

       结果测量：主要临床和安全终点在第60周由一个综合终点进行评估，并进行进一步的三年随访。评估包括活检证实的急性排斥反应的发生率，对注射nTreg相关不良反应的评估，以及过度免疫抑制的迹象。次要终点包括同种异体移植的功能、全面的探索性生物标志物组合等。

       对于所有患者来说，在肾移植前两周采集40-50毫升的外周血液就可以生产出产量、纯度和功能性都足够高的nTreg产品。三个nTreg剂量递增组均无剂量限制性**。nTreg组和参照组的同种异体移植物三年存活率为100%，临床和安全性特征相似。在接受nTregs治疗的11名患者中，有8名(73%)获得了稳定的单药免疫抑制，而对照组仍在接受标准的二联或三联药物免疫抑制(P=0.002)。

       在这个试验中第一：没有任何炎症反应迹象。第二：没有看到任何过度免疫抑制的临床感染现象，这之前是假定的安全性问题。作者认为，在没有T细胞受体或CD28刺激的情况下，Treg细胞在几天内失去激活，甚至死亡。因此，只有经过反复抗原刺激的Treg克隆才能保持其抑制能力，并能在体内扩张。第三，作者观察到输注的Treg产物的多克隆T细胞受体在体内随着时间的推移而转变为寡克隆模式，这表明了同种异体抗原驱动的选择过程。同样，在体外用同种异体抗原替代抗CD3/28的多克隆抗体，在几天内就会产生一个偏向的T细胞受体谱系，这表明即使在注射多克隆nTregs之后，也有特异性的免疫调节作用。第四，注射nTreg仅导致Treg计数暂时增加。四周后循环Tregs减少的原因可能是nTregs集中于发炎的移植物或缺乏持久的植入物。最后，nTreg组表达了较少的常规T细胞激活，自然杀伤细胞成熟，这可能表明nTreg在体内的作用方式。需要强调的是这个试验中有数据表明nTregs联合小剂量他克莫司单一疗法不能充分控制先前存在的致病记忆或效应免疫细胞。这一假说应该在后续研究中仔细研究。

       04、Treg疗法总结

       目前有两种主要的方法制造Treg细胞：在体内扩增Treg细胞和在GMP条件下体外扩增Treg细胞。大多数中心都专注于Treg的体外扩增，比较这两种方法的数据对于确定临床上利用Tregs的最佳方法至关重要。此外关于Treg异质性的讨论将有助于临床安全方案的开发。

       未来的另一个关键问题将是Treg细胞治疗试验中的免疫抑制管理。根据移植中心的方案，不同的患者目前接受不同的免疫抑制方案(例如：不使用类固醇，推迟钙调神经磷酸酶抑制剂的引入)，剂量不同。在设计试验时，考虑到这些免疫抑制剂是很重要的，因为同时免疫抑制可以调节Treg细胞的存活和功能。另一个未解决的问题是，Treg细胞的基因修饰是否可以增强它们对移植排斥反应的体内调节。关于Treg的异质性，尽管新技术可能有助于加深对Treg细胞及其亚群的理解，但将这些技术用于常规临床用途是不切实际的，在经济上也是不可行的。因此，关键问题是，我们需要深入到什么程度？我们可能只利用昂贵的新技术进行临床前实验，以确定和验证Treg细胞以获得最佳的体内活性。然后，可以对这些数据进行反向工程，使其适用于临床可用的分析，以便于在更大规模的多中心试验中使用。

       目前Treg疗法尽管试验数据有限，但在安全性和有效性已经初步显示出了疗效。随着基础科学研究的发展和进一步的临床研究，相信Treg细胞在肾移植的应用潜力会逐步释放。

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