RNA药物旨在通过基因的表达、沉默等功能治疗疾病，基因治疗被业界认为是继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物。寡核苷酸由人工合成小于100 nt (nucleotides)的修饰RNA或DNA单链或双链，包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA (miRNA)、适配体(Aptamer)、未甲基化CpG的寡核苷酸等。由于siRNA药物疗效较好、技术取得突破，目前最受关注。siRNA是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对， 通过与体内相关酶形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）降解目标mRNA，调低或抑制目标基因的表达。

       目前批准的5款siRNA上市药物总结如下。5款siRNA上市药物，其中有四款来自Alnylam公司，Inclisiran是Alnylam 转让给诺华。治疗领域主要位内分泌于代谢、神经、泌尿、心血管系统，靶向均是肝脏，除了Onpattro给药方式为静脉输注，其它均为皮下注射，均进行了核糖修饰和/或骨架修饰，除了Onpattro递送方式为LNP，其它均为GalNAc，分子量为14或17kD。

       图1 五款siRNA上市药物（截止2023.11）

       已上市的5款siRNA药物均使用了化学修饰和递送系统。因siRNA自身的物理化学特性，未经修饰的游离寡核苷酸类药物在给药后不仅会很快被机体清除，同时还有脱靶和产生毒副作用的风险。因此需要同时借助化学修饰和合适的递送系统来达到治疗目的。关于化学修饰，第一代化学修饰是对磷酸骨架的修饰，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化学修饰是核糖修饰，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修饰是最常用的类型。第三代化学修饰为核糖五元环改造，总结如下：

       图2 siRNA化学修饰

       单纯通过化学修饰还是很难使siRNA到达靶部位。因此，递送系统成了寡核苷酸药物研发中成功的关键，也是药物研发公司的技术护城河。目前已上市的5款siRNA药物，使用的递送系统为LNP（左图）和GalNAc（右图）。LNP主要由五部分组成：可电离阳离子脂质、胆固醇、辅助磷脂、PEG-脂质。其中，电离阳离子脂质是最关键的辅料，是siRNA递送的决定性因素。它在不同的pH条件下表现出不同的带电特征，在酸性pH值条件下带正电荷，而在生理pH条件下基本呈中性。脂材的可离子化特性为siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保护。目前已上市的4款GalNAc-siRNA偶联物均使用L96作为载体，结构均由3部分组成，分别为三触GalNAc靶头、连接臂以及siRNA分子。GalNAc以三价态的方式共价偶联至核酸3'末端，形成GalNAc-siRNA偶联物。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR) 的配体，ASGPR在肝细胞的膜表面高度特异性表达。GalNAc-siRNA偶联物通过特异性结合ASGPR，在内吞作用下，将siRNA从细胞表面转运至细胞中。 随后GalNAc-siRNA偶联物与ASPGR分离，ASPRGR回到细胞表面，而GalNAc-siRNA偶联物进一步解离，释放出的游离siRNA在细胞质中沉默基因发挥药效。

       图3 递送系统LNP, GalNAc

       寡核苷酸是化学合成药物，虽具备生物制品属性，但按新化学实体监管。寡核苷酸按新化学实体监管，不仅人们的科学认知尚存在一些缺口，从新药注册申报的角度，也存在一些监管指南空缺。目前国内尚无相关指导原则。除了ICH 系列指导原则外（ICH S6/M3/S7/S2）, 日本PMDA 2020年发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》可供参考；FDA也发布了用于工业界的相关指导原则，如寡核苷酸治疗药物开发的临床药理学考虑等。根据日本药监局2020年发布的《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价》指导原则，siRNA药物种属选择策略如下。目前已上市的5款siRNA，种属均是大鼠、食蟹猴。非啮齿动物选猴的主要原因如下：猴和人的目标mRNA具有高度或完全同源性，猴种属可以更好地评估siRNA放大的药理学效应。

       图4 种属选择

       根据已上市的5款siRNA药物，临床前安评总结如下。

       图5 五款siRNA药物临床前安评总结

       以递送系统LNP药物Patisiran，递送系统GalNAc药物Inclisiran为代表，分析临床前安评结果。Patisiran是Alnylam研发，于2018.8 FDA批准首 款siRNA药物。适应症为遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的周围神经疾病，靶点TTR（转甲状腺素蛋白）。临床给药途径，频率：静脉滴注，3周一次, 0.3 mg/kg。递送载体LNP，通过RNA干扰引起突变型和野生型TTR mRNA的降解，从而导致血清TTR蛋白和组织中TTR蛋白沉积的减少。Patisiran临床前安评结果总结如下：

       图6 Patisiran临床前安评总结

       图7 Patisiran临床前安评总结（续）

       Inclisiran研发公司Novartis/Alnylam，于2020.12欧盟首次获批，全球首 个 siRNA降胆固醇疗法药物，适应症原发性高胆固醇血症或混合性血脂异常，靶点PCSK9。临床给药途径、频率: 皮下注射，第0、3个月各给药一次后，维持期6个月一次，一年只需2次。递送系统GaINAc，作用机制Leqvio可与编码PCSK9蛋白的mRNA结合，通过RNA的干扰作用来防止肝脏生成PCSK9蛋白。Inclisiran临床前安评结果总结如下：

       图8 Inclisiran临床前安评总结

       图9 Inclisiran临床前安评总结（续）

       为了探究已上市的5款siRNA非临床毒性和临床主要不良反应是否有关联性，通过整理支持NDA的NHP 长毒试验毒性结果，以及临床警告和注意事项，非临床和临床关联性较强的是肝脏毒性，需要关注血生化一些指标变化，如ALT, AST。

       图10 Inclisiran临床前安评总结（续）

       已上市5款siRNA药物，进行了免疫毒性考察，如抗药抗体、细胞因子、补体、免疫表型。结果总结如下：

       图11 五款siRNA药物免疫毒性结果总结

       理论上讲，若siRNA和靶mRNA准确地结合在一起，则可成功的沉默靶基因。然而，许多siRNA都存在siRNA脱靶，并且大多数siRNA分子可能并不像以前认为的那样具有特异性。siRNA的引入可导致脱靶效应，即抑制目标基因靶标以外的基因，导致危险的基因表达突变和意外后果。根据日本发布的《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》，寡核苷酸的毒性分析分为靶向毒性。脱靶毒性。靶向毒性指靶点相关的药理学活性放大所引起的毒性反应；脱靶毒性分为杂交依赖、非杂交依赖。杂交依赖脱靶毒性指与靶序列相似的序列杂交而产生的脱靶效应，非杂交依赖脱靶毒性指不依赖于杂交，由分子结构和物理/化学性质所引起的脱靶毒性。杂交和序列相关因素，应在药物设计时应被优先考虑。靶向毒性的评估主要依赖于收集有关靶向的生物功能、组织表达模式的可用信息，以及来自同一靶向的其他药物的公开信息。杂交依赖脱靶毒性建议采用生物信息学的方法、体外考察人源细胞基因表达的方法，进行评价，非杂交依赖脱靶毒性由于来自其物理、化学性质，建议参考化学药物非临床评价的一般要求。

       已上市5款siRNA药物均有肝靶向性，目前LNP组织靶向主要局限于肝脏，IV后80%-90%的LNP会进入肝脏，最终被肝细胞吸收；GalNAc-siRNA经ASGPR介导发生细胞内吞而进入靶组织， ASGPR在肝细胞上大量表达。组织分布结果均显示肝脏浓度最高，如Lumasiran 猴10mg/kg时，AUC 76700h*μg/mL, 且消除半衰期长， 高达409h。用于支持NDA的猴长毒试验中，组织病理均发现肝脏变化（无肾脏变化），从轻到重依次是：（1）肝细胞/枯否细胞嗜碱性颗粒：可能为供试品或其代谢产物*，可能是细胞摄取寡核苷酸的适应性改变；（2）肝细胞空泡化：可能为继发于胞浆内嗜碱性颗粒蓄积的改变；（3）炎症浸润：高浓度药物分布时，会激活促炎性通路（4）肝细胞单细胞坏死：高剂量下嗜碱性颗粒大量蓄积时可观察到病理损伤，如肝细胞坏死。此外，大部分药物还伴随血生化临检指标变化，如ALT, AST升高。是否是有害变化，要根据是否对组织本身损伤，是否引相关的指标变化，是否可恢复，其它的siRNA药物是否有类似改变等综合判断。

       除了肝毒性，序列相关引起的脱靶毒性，还有免疫刺激反应，其毒性在很大程度上取决于核苷酸序列设计和化学修饰。siRNA药物通过激活先天免疫系统，导致注射部位反应(如Patisiran，Inclisiran)、血小板（PLT）减少(如Patisiran, Givosiran)。免疫刺激评估，可在体外用分离的外周血单核细胞或全血测定预测细胞因子释放来评估。

       杂交与序列均无关毒性，如凝血功能改变，siRNA药物通过抑制凝血级联反应中的因子IXa和辅助因子VIIIa，进而选择性的抑制了部分凝血酶的作用时间，从而以一种与杂交和序列无关的方式抑制凝血（如Patisiran，Lumasiran APTT轻微升高）。此外，siRNA药物还可以结合抑制性因子H激活补体旁路，补体过度激活可使补体功能改变，引发继发性炎症和血管炎等（如Patisiran C3a升高，发现肝脏炎症浸润、输注部位血管周围炎症）。

       2018年第一款siRNA药物Onpattro获批，对siRNA药物领域有巨大的振奋作用，是诺贝尔奖成果从概念走向实际治疗用途的一个光辉里程碑。截止目前已有5款siRNA药物上市，通过对五款已上市siRNA药物临床前安评总结分析，为此类药物临床前方案设计提供一些参考。相信将来会有更多的siRNA药物上市，相关的临床前指导原则也会发布。

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       作者简介：磐盛，主要从事临床前安评、项目管理等工作，负责过的药物类型有小分子，单抗，双抗，多肽，ASO, siRNA, mRNA，ADC，疫苗等。通过项目管理，提供一体化新药研发和申报解决方案，让更多药物获批临床，造福病患。