新兴的液体活检分析方法

       以精准肿瘤学的需求来看，现有的液体活检技术还存在很多不足。但通过扩大信息获取与检测的范围，我们有望实现液体活检技术的真正潜力。在这一段中，我们也将介绍目前新兴的一些液体活检方法。

       1. 组织与癌症特异的DNA甲基化模式分析

       在表观遗传学中，CpG的甲基化是基因表达和组织分化的重要调控方式。近年来，随着人们对组织特异甲基化组学的了解不断加深，通过分析甲基化的模式，我们可以推断出cfDNA的组织来源，检测癌症。由于在癌症发病初期，DNA就会出现甲基化修饰的变化，该技术有望在早期就协助医生做出癌症诊断。这一理念已经在实验中得到了验证——2017年的两篇论文表明，我们有望在乳腺癌和卵巢癌得到临床确诊的2年前，就在外周血液中检测出肿瘤特异的甲基化变化。但这一技术目前也存在着瓶颈，主要难点在于获取足够数量的循环肿瘤细胞，以及对于单细胞甲基化模式的分析。

       2. 核小体位置分析

       血液中cfDNA的主要形式是受单个核小体保护（mononucleosomal protected）的DNA。和甲基化模式类似，来自不同细胞的cfDNA，其核小体所处的位置也有所不同。因此通过对这些核小体位置的分析，我们也能推导出cfDNA的来源。

       3. miRNA分析

       在生物学研究中，循环RNA在RNA-seq，qPCR，以及microarray等方面有着多样的应用。在诸多RNA内，miRNA由于其在血浆或血清中的稳定性得到了广泛的关注，也有不少人期望能将其开发成有用的诊断工具。举例来讲，有些科学家希望能使用低剂量计算机断层扫描（low-dose computed tomography ，LDCT）技术，在高风险的个体中对肺癌进行早期检测。而miRNA的评估有望减少LDCT技术较高的假阳性率。一些研究表明，miRNA与LDCT技术的结合，能将后者的假阳性率减少5倍！

       4. 分析细胞外囊泡的转录组和基因组

       细胞外囊泡是核酸与蛋白质的载体，在细胞与细胞，乃至器官与器官间的交流中起到了重要作用。从运输能力上看，细胞外囊泡最多能运载近100个蛋白质和约10kb长的核酸。在核酸方面，miRNA大约占了40.4%，piwi-互作RNA占了约40%，剩下的则是假基因（pseudo genes），lncRNA，tRNA，以及mRNA。这些RNA分子中的信息有望用于确认癌症起源，做出早期诊断。除了核酸分子外，细胞外囊泡上的一些粘附分子（如整合素）也能用于推断器官特异的癌症转移。

       值得一提的是，外泌体（exosome）可以由活性癌细胞直接分泌。与ctDNA进行配合，可以从多个角度展示肿瘤的生物学特征，做出更准确的诊断。当然，健康组织也会分泌大量外泌体，其中的遗传物质也会带有变异。因此在临床应用上，我们还需要更好地对外泌体的行动进行追踪。

       5. 经过肿瘤“教育”的血小板

       肿瘤细胞有时会将生物分子转移到血小板上，这个过程也被形象地称为“教育血小板”。有趣的是，这些信息可以被用于区分癌症患者。在一项研究中，科学家们收集了228个癌症样本，而对于这些经过肿瘤“教育”的血小板进行RNA-seq，科学家们可以将局部和转移癌症患者与健康人区分开来，准确度达84%-96%。区分肿瘤来源的准确度也达到了71%。这是因为不同的癌症类型，会把不同的分子带给血小板。当然，这一技术目前还停留在较初步的阶段。为了让它得到更好的应用，我们还需要了解肿瘤“教育”血小板的具体过程。

       6. 蛋白质分析

       细胞的正常运作离不开蛋白质，而许多疾病的根源正是蛋白质的突变。然而除了PSA（前列腺特异抗原）外，目前临床上我们能使用的蛋白标志物少之又少，且大多无法区分其来自哪些组织或癌症。蛋白质组学的蓬勃发展给了人们契机，让我们建立了高质量的蛋白关联性图谱。目前，我们已经可以利用这些技术，明显提高液体活检在早期癌症中的检测率。

       7. 代谢物分析

       肿瘤的生长发育往往会影响到人体生理上的变化，尤其是全身的代谢状况。对于肿瘤来说，它们能肆意改变自己的代谢通路，而血液中的代谢产物可能会成为有用的癌症标志物。目前比较为人熟知的一个案例是BCAA，它能预示肿瘤发育早期对代谢调控的干扰——胰 腺癌的发病早期，BCAA水平会有所上升。而在非小细胞肺癌里，BCAA的水平则会下降。这些结果表明代谢物的组成可能成为液体活检的重要部分。

       8. 活性循环肿瘤细胞分析

       近年来，单细胞分析技术有了飞跃式的发展，这也让科学家们得以更为详细地分析循环肿瘤细胞内的基因组、转录组、蛋白质、以及表观遗传组信息。其中，来自活性循环肿瘤细胞的信息对于评估癌症转移有着重要的作用。除此之外，这些细胞也能被用来建立患者特异的肿瘤模型。但首先，我们还需要解决不同癌症种类中循环肿瘤细胞的丰度问题。比如非小细胞肺癌就很少会带来循环肿瘤细胞。

       液体活检技术面临的挑战

       任何一项技术在刚刚迈入应用之际，总是充满了挑战，液体活检也不例外。尽管有多种新兴分析方法不断涌现，但这一技术的发展前方依旧充满挑战。

       1.真正理解血浆成分

       关于液体活检的争议之一，在于我们是否真正了解了血浆成分。举例来讲，过去人们认为ctDNA主要来自凋亡的癌细胞，但最近对ctDNA的一些分析却找到了一些和癌细胞增殖有关的变化，刷新了认知。因此为了更好地理解细胞如何将DNA释放到循环系统中，我们还需要更深入地了解健康人与癌症患者中，血浆的组分与各个组织之间是怎样的一个关系。截止到目前，我们做的还非常不够。

       举例来说，不少关于组织特异性的研究，其专注的只有少数集中细胞类型，探索血浆cfDNA来源的研究也寥寥无几。这容易给分析带来偏差——不少研究指出白血球是循环核酸的主要来源，占比范围在42%-90%。然而最近的一项研究却发现，幼红细胞来源的DNA在健康人里，中位占比大概是30.1%，而这是先前人们从来没有报道过的组织来源。可想而知，不同的分析方法得出的结论究竟有多大的区别，这也反映了我们对于血浆cfDNA组成的无知。

       2. 液体活检与免疫肿瘤学

       液体活检与免疫肿瘤学的交织，是最近的研究热点之一。当循环肿瘤细胞离开原发肿瘤之后，就会暴露在免疫监控之下。因此，它们也需要一定的免疫逃逸机制才能生存。目前我们已经知道，这些循环肿瘤细胞有能力改变自己的MHC I呈递、改变NK细胞配体表达、或是下调FAS/FASL的表达。理解这些变化，有助于免疫肿瘤学的发展。

       通过对循环肿瘤细胞进行液体活检，还能带来实际的应用价值。最近，人们通过抗PD-L1抗体，发现在这些细胞上也有PD-L1的表达。这些信息可以用于患者细分。

       此外，我们还能通过分析ctDNA里的肿瘤突变负担（TMB），了解检查点抑制剂的潜在效果。这是因为TMB越高，产生新抗原的几率就越高。一些研究也表明，TMB能用来找到哪些患者在免疫疗法的治疗后，在临床上能有更好的预后。

       3. 对多种参数的测量与整合

       如果要给液体活检展望一下未来，成功检测最小残留病灶可以说是一个目标。最终，我们希望能在早期对癌症进行诊断。要实现这些目标，有时我们只需要检测一个指标就够了。最近，2017年药明康德生命化学研究奖得主卢煜明教授领衔的一支团队发现，只要在外周血液里检测Epstein–Barr病毒的DNA，就能筛选出早期的鼻咽癌患者。许多专家认为这项研究堪称是里程碑。

       但更多的情况下，一个指标是远远不够的。在涉及多个指标的案例中，我们还需要考虑参数整合的问题。在最早的一些尝试中，人们主要综合的是ctDNA与蛋白标志物。举例来说，CA19-9、TIMP1、以及LRG1等蛋白标志物，辅以对KRAS基因突变的检测，能够找到肿瘤可切除的前列腺癌患者，且检测率要高于只使用ctDNA的方法。

       最近，一种叫做CancerSEEK的早期癌症检测策略浮出水面。在一项招募了1005名志愿者，涉及8种常见癌症类型的临床研究中，蛋白质与遗传标志物的组合，猜对癌种的中位正确率为70%。由于致癌基因突变未必具有组织特异性，想要区分癌症的来源，还是要靠对蛋白质的分析。但这种技术容易带来假阳性，且在早期癌症的检测中效果不佳。

       尽管如此，研究人员们依旧指出，通过整合不同标志物的分析结果，液体活检的潜力看好。在前列腺癌与胰 腺癌的诊疗上，我们已取得了一些可喜的进展。

       4. 机器学习遇上液体活检

       人们也意识到，综合考量多种指标需要较高的计算能力，而机器学习算法则有望自动发现和检测癌症特异的指标，助力液体活检。这可能涉及简单的逻辑回归，也可能涉及复杂的多层人工神经网络。

       事实上，机器学习技术已经在液体活检中取得了一些成绩。比如利用深度学习的方法，我们能以更高的灵敏度和特异性去探测循环肿瘤细胞；用基于神经网络的miRNA分析，我们可以区分健康女性和罹患卵巢癌的女性，特异性达。

       但目前利用机器学习算法的短板，在于独立观察数据的不足。该综述指出，目前患者的样本量一般在几十到几千之间，而按碱基的分辨率计算，单名患者就可能产生数百亿的数据。在理想的情况下，设置机器学习算法时，前者应比后者的数量来得更多。比如经典的图像处理AI，处理的样本高达数百万，而潜在的分析特征只有几千，两者的数量级之间有着明显的差距。在数据不足的前提下，机器学习算法可能会出现过度拟合。它能很好地解释训练数据，但无法用于新的数据。

       结语和展望

       液体活检在肿瘤学方面的应用日益增多。然而，我们需要对液体分析物的产生机理和水平动态进行更深入的了解，同时需要确认液体活检的临床有效性和临床实用性，这样才能进一步推广液体活检的临床应用。

       目前，大多数检测都只聚焦于一种分析物，然而将血液中存在的多种分析物的数据综合起来构成的多参数检测可能大幅度改善检测的精确度和使用范围。这些检测技术的开发需要使用创新统计工具，它们能够使用多维机器学习方法来整合从一个样本中获取的大量数据。

       因此，未来的液体活检研发将横跨多个学科，包括基础生物学和生理学、分子生物学、检测技术、统计学和机器学习。非常关键的一点是，只有当液体活检的临床有效性和临床实用性得到证明之后，这项技术才能发挥它全部的潜力，为基因组驱动的肿瘤学和癌症患者的临床管理带来重大影响。