第二代芯片HB-Chip

       资料来源：TranslLung Cancer Res. 2017 Aug;6(4):473-485

       微流免疫磁珠富集：目前已经有多家公司或研究单位应用免疫磁珠技术来解决表面捕获装置的局限性，该技术能很好地控制细胞捕获与释放。此类芯片以CTC-iChip为代表，该芯片将免疫磁珠和微流控技术结合起来用于CTC富集。CTC-iChip首先使用塑料微柱阵列将小个的红细胞和血小板过滤出去，然后在磁场中通过“惯性聚焦”作用将较大的细胞排成一行，并使用阳性或阴性富集方法分离CTC与白细胞。CTC-iChip的捕获效率可以高达98%，但是对于直径较小（<8微米）的CTC并不适用。除了CTC-iChip，也有多种芯片技术使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，Fluxion公司的Isoflux，这些芯片的捕获效率与第二代芯片相近，为90%左右。

       上述芯片主要基于CTC的生化特性将其从血液中分离出来，具有特异性高的优点，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞。目前大部分技术采用EpCAM作为CTC的表面特异性抗原，但是在不同的肿瘤亚型中，EpCAM的表达各不相同。依赖EpCAM的CTC分选芯片会丢失不表达或低表达EpCAM的CTC，然而这些CTC具有更大的浸润性和侵入性。因此，缺乏公认的表面标志物限制了亲和性富集在CTC分选中的应用。

       为了无需依赖表面标志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于细胞大小和变形性差异的芯片技术，基于细胞力学性质的芯片技术和基于细胞介电性质的双向电泳技术。

       基于细胞大小和变形性差异的芯片技术：该技术通过在芯片内部设计不同的小于CTC直径的微孔、微过滤网、微柱等结构，当含有CTC的样品流经芯片时，CTC由于直径大而被卡在结构内，血细胞则随缓冲液一起流出，较大的白细胞被结构捕获时，由于CTC比白细胞变形性小，加大缓冲液流速时，白细胞被冲走，CTC则留在芯片内，从而达到分离目的。Abnova公司的ClearCell?CXSystem就是基于此原理分离CTC的代表，该系统还可以动态监测CTC的捕获过程。芯片主要结构由圆柱形微柱构成，每个捕获单元由三个圆柱排列组成一个“爪形”结构。

       ClearCell?CXSystem结构示意图

       基于细胞大小和变形性差异分选CTC的优势在于：操作过程简单，捕获效率高，能够实现高通量富集，成本远远低于CellSearch，无需依赖表面标志物，分选出的CTC可以用多种抗体进行标志物鉴别。该方法存在的问题是仅仅基于细胞尺寸和变形性不同而进行过滤式分选，由于CTC尺寸和白细胞有重叠部分，CTC有可能会通过滤网或微柱的间隔；而且在较大的机械力作用下，CTC随着缓冲液流过微柱或者滤网时容易破裂。这些因素会对分离纯度和细胞活性造成一定影响，这类芯片在设计内部捕获单元时应避免使用带棱角的微柱，比如三角形、长方形、正方形等。

       基于细胞力学性质的芯片技术：这些技术主要基于惯性力或确定性侧向位移。基于惯性力的惯性微流技术通过使用两种力（梯度剪切升力和管壁效应升力）在微流体装置中应用惯性效应，基于尺寸被动地将CTC与其他血细胞分离。这些升力的大小和方向取决于通道尺寸，通道纵横比，流速和颗粒直径。目前该技术的商业化平台主要有Vortex（直线型通道）和ClearCellFX（单螺旋通道）。

       ClearCellFX芯片

       资料来源：LabChip. 2014 Jan 7;14(1):128-37

       基于确定性侧向位移设计的微流控芯片原理是芯片内具有相对于流体流动方向呈一定角度的微柱阵列，尺寸不同的颗粒在流动过程中具有不同的运动轨迹，尺寸大的颗粒会发生侧向位移向一侧汇聚，尺寸小的颗粒会按原轨迹运动，在芯片上设计相应的两个出口，即可收集到相应的细胞。

       基于细胞力学性质差异分选同基于细胞大小和变形性差异分选一样，装置简单、无需复杂的实验设备、成本低。样品无需标记，不影响CTC分子特性和表面标志物；细胞在微流环境中损伤小，分选后细胞的存活率更高，可继续培养和做后续分析。然而，由于血液的复杂性，细胞间的相互作用不容易控制，当处理细胞浓度较高的样品时，分选效率降低。另外，该方法单纯基于细胞的物理特性实现，而人体血液是高度复杂的血浆、红白细胞、血小板、蛋白质混合物，且血液黏度是水的3倍以上，因此芯片有时容易发生堵塞现象，影响分选效率，分选出的CTCs可能存在假阳性结果。

       基于细胞介电性质的双向电泳技术：双向电泳（DEP）是微流控芯片上一种常用的细胞分选方法，其原理是不同类型的细胞在电场中介电性质不同，所受介电力的大小和方向不同，在不同介电力作用下向不同方向移动，在电场中实现目的细胞的分选。目前，商业化的双向电泳技术主要有ApoCell公司的ApoStream，SiliconBiosystems公司的DEPArray。

       双向电泳法的优势是可将不同癌种表面标志物表达相同、尺寸相似、形态相似的细胞分离出来。但是在较大的流速下，微弱的电泳力没有充足时间感应流过的CTC，从而难以达到快速分选。该方法存在的另一个问题是电场力可能会对细胞活性和表面特性产生影响，不利于对CTC进行后续培养和分子特性分析。双向电泳法分选时间长，但准确率高，因此，较适合于少量细胞的分选。

       CTC富集技术的发展历程

       2.2 发展趋势

       2.2.1 微流控芯片技术有望得到更广泛应用

       微流控芯片技术由于其自身特点在细胞分选方面具有一定的优势，包括芯片体积小、速度快、通量高、操作简便、样品和试剂消耗低、易在芯片上集成多用途功能部件等．经过十多年的发展，该技术已经在CTC分选中越来越广泛的应用，有望在将来成为CTC富集和检测工具之一。该技术目前也面临着一些技术上和临床上的挑战：芯片通道空间小，实验过程中管道容易被堵塞；有些特殊的芯片造价昂贵不便于推广应用；在进行细胞分选时，有些方法难以确保较高的细胞活性；缺乏统一的CTC表面标志物等．如何改进微流控芯片技术在进行细胞分选时所遇到的上述问题，充分发挥其优势，将是接下来研究的关键。

       2.2.2 开发纳米技术和适配体在微流控芯片中的应用

       CTC检测的灵敏度和可靠性非常重要，7.5ml血液中有1～5个CTC在临床上都是有意义的，假阴性和假阳性都可能对样品分析、临床诊断产生重要影响。随着纳米技术的不断发展，功能化纳米材料修饰的微流控芯片广泛应用于CTC的富集和检测。抗体连接的功能性纳米粒子能够为CTC与抗体的结合提供更大的接触表面积，因此纳米技术也成为细胞分选中备受瞩目的一项新技术。适配体能提供特异性CTC靶点，因此微流控芯片的应用也许可以向基于新的CTC捕获探针（如核酸适配体探针等）方面发展，寻找特异性强的适配体探针，以提高CTC检测的可靠性。

       2.2.3 基于多种捕获方法设计微流控芯片

       亲和性富集法特异性高，能有效分选形状、大小相似的不同种类细胞，但是阳性富集法大都使用EpCAM，会丢失不表达或低表达EpCAM的CTC，而阴性富集法只是去除了白细胞，CTC纯度不高。物理特性富集法不依赖细胞表面标志物的表达，捕获的细胞数量多，能够克服CTC在蛋白表达上的异质性，但是无法克服CTC在物理特性的异质性。因此，采用多种捕获方法相结合，充分利用各自的优点设计CTC捕获微流控芯片是将来的发展趋势。如第三代芯片CTC-iChip，其利用确定性侧向位移、惯性聚焦和免疫磁珠富集CTC。

       CTC富集技术比较

       三、国内外CTC公司的富集技术图谱

       国外部分CTC公司的富集技术图谱

       国外CTC公司在粗分离技术、免疫磁珠技术和微流控技术等方面均有布局，而且微流控技术应用较多。这表明国外CTC公司紧随技术发展趋势，有望提高CTC的捕获效率并将CTC检测快速应用于临床。

       国内CTC公司的富集技术图谱

       目前国内进行CTC检测的公司大约有20多家。与国外公司类似，国内公司在粗分离技术、免疫磁珠技术和微流控技术等方面均有布局。然而不同的是，国内公司基于生化特性的富集方法主要是免疫磁珠技术，微流控技术应用较少，而基于物理特性的富集方法主要是微流控技术。这表明在微流控芯片技术方面，国内公司的应用程度低于国外公司。微流控芯片技术作为目前CTC捕获技术发展的主要趋势，可能会对国内液体活检公司带来一场技术革新和升级。除了自主研发，国内多家公司已经与国外公司达成技术引进或合作开发协议：博奥晶典和新加坡液体活检公司Celsee合作独家引入后者的CTC检测技术平台；丽珠集团与美国Cynvenio公司合资组建了专注于液体活检的丽珠圣美；贝达药业与美国CapioBiosciences公司合作，引入了OncoSenseCTC捕获技术。由此可见，国内CTC公司仍需要紧跟技术发展趋势，不断研发CTC富集技术，提高细胞的捕获效率和纯度。

       四、CTC分析方法

       利用亲和特性或物理特性法可富集到CTC，接下来还需要结合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面，在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。常用的CTC分析技术如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。

       捕获CTC的分析（检测）技术

       资料来源：浙商证券

       小 结

       由于血液中CTC的含量极低，目前主流的检测方法是先捕获（富集）后检测，少量方法是不捕获（富集）直接检测。CTC的富集方法主要是基于其生化特性或物理特性或两种特性的结合，已经历了三代的发展历程。微流控芯片技术凭借多种优势已经在CTC分选中得到越来越广泛的应用，有望在将来成为CTC富集和检测工具之一。但该技术也面临着一些技术上和临床上的挑战，需要克服这些问题并充分发挥其优势。同时也需要采用多种捕获方法相结合，充分利用各自的优点设计CTC捕获微流控芯片。与国外公司相比，国内公司需要紧跟技术发展趋势，加大微流控芯片技术在CTC富集方面的应用。