重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
(96T)
使用前请仔细阅读说明书。若有任何问题,请联系我们。
试剂盒用途
该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。
试剂盒基本参数
灵敏度 < 1 ng/ml
检测范围:0.25 - 64 ng/ml
特异性:可检测重组羧肽酶B,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性:板内,板间变异系数均 < 10%。
工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期:6个月
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
中文名称 |
规格 |
保存条件 |
抗体包被的ELISA酶标板(96孔可拆卸) (MicroELISA Plate(Dismountable) |
8孔×12条 |
-20℃ |
冻干标准品(40ng/支)(A1) (Reference Standard) |
4支 |
2-8℃ |
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)(Concentrated HRP-Detection Ab) |
1支×0.2 mL |
-20℃ |
标准品 & 样品稀释液 (P1) (Reference Standard & Sample Diluent) |
1瓶×20 mL |
2-8℃ |
HRP-抗体稀释液 (P2) (HRP- Ab Diluent) |
1瓶×15 mL |
2-8℃ |
浓缩洗涤液-1(25 X)(P3) (Concentrated Wash Buffer (25x)) |
2瓶×20 mL |
2-8℃ |
浓缩洗涤液-2(25 X)(P4) (Concentrated Wash Buffer (25x) |
2瓶×10 mL |
2-8℃ |
显色底物(TMB)(A3) (Substrate Reagent) |
5支×0.125 mL |
-20℃ 避光 |
底物稀释液(TMB)(P5) (Substrate Reagent) |
1瓶×15 mL |
2-8℃ 避光 |
反应终止液 (P6)(Stop Solution) |
1瓶×10 mL |
2-8℃ |
封板覆膜(可重复使用) (Plate Sealer) |
5张 |
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产品说明书(User Manual) |
1份 |
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质检报告(Certificate of Analysis) |
1份 |
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说明:
1、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月,4℃存放勿超过一周。
试验所需自备物品
2.高精度移液器,EP管及一次性吸头
3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
4.吸水纸
待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果您的样品中检测物浓度高于标准品值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
检测前准备工作
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。
2.洗涤液配制
将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。
提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。
3.标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为32ng/ml), 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度: 32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 ng/ml。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。
倍比稀释方法
取7只EP管,每管中加入500 μL标准品&样品稀释液,从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例(以500 μL为例)
提示:一管直接作为空白孔。
4.HRP标记抗体工作液配制
实验前请先将抗体管低速离心,以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1:62.5),当日使用。
5.TMB显色工作液配制
实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =1:20),当日使用。
洗涤方法
操作步骤
1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。
2.洗涤:弃去液体,甩干,在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL,浸泡2-3分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL,混匀,酶标板覆膜并置于37℃孵育30钟。
4.洗涤:用 洗涤液1 洗板3次,方法步骤同2。
5.洗涤:用 洗涤液2 洗板2次,方法步骤同2。,
6.每孔加底物显色工作液(TMB)100 μL,酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。
提示: 根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
7.每孔加终止液50 μL,终止反应,室温放置1分钟。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。
8.用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。
结果判断
1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。
2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或ELISA Calc(请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
3.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。
4.典型数据
由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
X-浓度(ng/mL) |
32 |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
0.5 |
0 |
Y-OD450/650nm |
1.816 |
1.370 |
0.801 |
0.403 |
0.227 |
0.150 |
0.114 |
0.081 |
Y-OD450/650 nm(去本底) |
1.735 |
1.289 |
0.720 |
0.322 |
0.146 |
0.069 |
0.033 |
0 |
回收量(ng/mL) |
32.02 |
15.97 |
8.05 |
3.92 |
2.02 |
1.06 |
0.54 |
— |
回收率% |
100.1 |
99.8 |
100.6 |
98.0 |
101.0 |
106.0 |
108.0 |
— |
注意事项
10、不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。
问题分析
若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息找出原因。
问题描述 |
可能原因 |
相应对策 |
标准曲线梯度差 |
吸液或加液不准 |
检查移液器和吸头 |
标准品稀释不正确 |
溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解 |
|
洗涤不完全 |
保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量 |
|
显色很弱或无色 |
温育时间太短 |
保证充足的温育时间 |
实验温度不正确 |
使用推荐的实验温度 |
|
试剂体积不够或漏加 |
检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加 |
|
稀释不正确 |
||
读数数值低 |
酶标仪设置不正确 |
在酶标仪上检查波长和滤光片装置 |
提前打开酶标仪预热 |
||
变异系数大 |
加液不正确 |
检查加液情况 |
背景值高
|
检测抗体的工作浓度过高 |
使用推荐的稀释倍数 |
酶标板洗涤不完全 |
重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。 |
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洗液有污染 |
配制新鲜的洗液 |
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灵敏度低 |
ELZSA试剂盒保存不当 |
按说明书要求保存相关试剂 |
读数前未终止 |
OD读数前应在每孔中加入终止液 |