外泌体是由多种类型细胞在正常或病理状态下分泌的特异性膜囊泡，在细胞间的信息通信和交流中发挥着十分重要的作用。外泌体广泛存在于血液、尿液、唾液和乳汁等多种体液中，具有生物相容性好、可生物降解、无毒、免疫原性低、装载能力强、能够穿越生物屏障等优势，从而作为一种极有价值的天然药物递送载体逐渐得到了广泛的研究与应用。

       外泌体在药物递送中的优势

       外泌体作为具有纳米级别的天然外囊泡，与其他传统的药物递送系统相比具有显著地优势。①与细胞疗法相比，外泌体更易储存且安全性较高。如外泌体递送基因药物不会在体内不同部位沉积导致免疫排斥。此外，外泌体还可以从患者体液中分离，经修饰后移回同一患者，大大降低了临床中出现免疫反应的可能性。②外泌体递送药物可以提高药物的稳定性。如外泌体可以保护核酸在运输过程中不被核酶水解。同时，外泌体可直接进入细胞液，避免代谢消除，从而延长药物在体内的循环时间。③外泌体为纳米级分子，且携带细胞表面物质，因此具有较强的穿透各种生物屏障的能力。④外泌体具有基于供体细胞的天然靶向能力。如肿瘤细胞来源的外泌体携带肿瘤特异性抗原、蛋白质和 RNA等物质，可以起到抗肿瘤免疫的作用。

       外泌体载药方式

       外泌体的天然属性使其成为非常有潜力的药物递送载体，可用于递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。目前，将药物载入外泌体的方法可分为内源性载药和外源性载药。

       内源性装载是对亲本细胞进行修饰，使其分泌的外泌体载有功能分子，将治疗药物分子在外泌体生成过程中整合到外泌体内，让细胞成为载药外泌体的活工厂，直接生成想要的外泌体。内源装载是在产生外泌体的细胞上做文章，根据外泌体产生的过程对细胞进行适当改造修饰，通常涉及蛋白/多肽的融合表达、基因药物的过表达等，让其产生携带目标分子的外泌体。与外源装载相比，内源装载的实验难度更大，周期更长。

       外源性装载是在分离天然外泌体后，对收集到的外泌体进行相应的药物装载，包括直接共孵育法、超声法、电穿孔法、挤出法和反复冻融法，相比内源装载，外源装载操作更简单，批次间的稳定性更高，更适合放大化生产。

       ①直接共孵育法是直接将外泌体与药物放在一起孵育，药物沿着浓度梯度与外泌体融合，包载效率取决于药物的极性大小，疏水性的药物装载率高于亲水性药物，同时分子量较小的药物更容易穿过外泌体膜进入外泌体。虽然此种装载方式对设备要求低且简便易行，但是其装载效率偏低，且载药效率易受药物分子量、亲疏水性的影响，因此直接共孵育法的应用受到了限制。

       ②超声法是将外泌体与小分子或蛋白质药物混合，然后通过均质探头超声破坏外泌体膜的完整性，从而实现药物的包载。外泌体膜上磷脂分子之间结构比较紧密，限制了外泌体的载药效率。超声波能提供能量和机械力，使外泌体膜上暂时形成孔隙，从而使得药物分子更容易进入外泌体。在超声处理后，载药外泌体需要在特定的温度下孵育至少1 h，让外泌体膜结构恢复。超声法具有载药效率高、能持续释药的优点，不过也可能导致外泌体聚集并影响其表面蛋白结构。

       ③电穿孔法是通过电场作用，使悬浮在导电溶液中的外泌体膜上形成可恢复的微小孔道，药物或核酸可通过这些微孔扩散进入外泌体内部。该法操作简便，已广泛应用于包载小干扰 RNA(siRNA) 或微小核糖核酸 (microRNA 或 miRNA)，但同时可能导致RNA沉淀或外泌体聚集，降低药物装载效率。

       ④挤出法是将外泌体与药物的混合物装入具有多孔膜（一般孔径为100～400 nm）的脂质挤出机中，在挤压过程中实现药物包载。该法载药效率高，所得到的外泌体粒径均一，不过该法的机械力可能会改变外泌体膜的性质，如膜电位、膜蛋白结构等。

       ⑤反复冻融法是将药物与外泌体在室温下孵育一段时间，再在-80 ℃或液氮条件下迅速冷冻，然后解冻，在快速冷冻过程中形成的冰晶可使外泌体脂质膜破裂，然后在缓慢融化的过程中，暴露出的脂质重新融合，并将药物包封于其中，如此重复至少3次，可保证药物的包封。该法操作简单、条件温和、不易破坏生物活性物质、有大规模生产的前景，但是会诱导外泌体的聚集且包封率一般低于超声或挤出法。

       外泌体载药的应用

       1、癌症的基因治疗

       研究表明，利用肿瘤外泌体装载miRNA126 可用于治疗非小细胞肺癌。由于肿瘤外泌体具有组织偏向性，装载miRNA126 的肿瘤外泌体能够聚集在肺癌组织中抑制肿瘤的生长。利用天然牛奶来源的外泌体装载siRNA靶向可作用于血管内皮 生长因子（VEGF）、EGFR、蛋白激酶B（AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS），从而抑制肺癌转移。研究发现，将siRNA装载进外泌体后，可以显著地减少siRNA 的降解，而且在多种肿瘤细胞中，靶基因的表达被显著抑制。利用骨髓提取的间充质干细胞来源的外泌体装载 miR-142-3p 核苷酸抑制剂来抑制乳腺癌细胞内的 miR-142-3p 的表达，研究结果表明，骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以在最快3 h内将基于锁核酸修饰的miR-142-3p 抑制序列递送到乳腺癌细胞中，并下调该细胞中miR-142-3p 的表达，从而实现对肿瘤的治疗。

       2、癌症的小分子治疗

       研究证实，抗癌药物如紫杉醇(PTX)和阿霉素( DOX)能够成功载入外泌体，进而用于抗肿瘤治疗。通过利用外泌体运送紫杉醇到对应的肿瘤部位进行抗肿瘤的研究中，由于间充质干细胞(MSC)可自主归巢至肿瘤微环境，所以不需要通过基因操作就能够有效的输送紫杉醇而且不会破坏其生物活性，即使小泡溶液蛋白质浓度较低时也可诱导肿瘤细胞凋亡。体外试验表明，其对癌细胞的抑制效果与单纯使用紫杉醇的效果相比基本一致。

       有学者利用透明质酸修饰外泌体并装载阿霉素用于抑制CD44表达阳性的肿瘤细胞，因为透明质酸可以与肿瘤细胞表面蛋白CD44 高度特异性结合，而A549 和 MDA-MB-231 等肿瘤细胞表面的CD44 高表达，所以透明质酸修饰的外泌体能够特异性地靶向CD44 高表达的肿瘤细胞。利用原位瘤细胞分泌的外泌体装载阿霉素用于预防肿瘤转移，从原位瘤细胞脱落到血管的肿瘤细胞会在远端形成转移位点，而原位癌来源的外泌体上具有同样的靶向蛋白能到达特定的预转移位点，利用这一特性载药外泌体可特异性地聚集到预转移位点干预肿瘤转移。

       3、外泌体载药用于其他疾病

       研究报道，装载有IL-10(白细胞介10)的树突状细胞分泌的外泌体具有免疫抑制作用，可降低T细胞增殖。在小鼠胶原诱导的关节炎体内模型研究表明，单剂量的治疗性外泌体可有效地抑制了疾病的进展，并降低关节炎的严重程度。类似的，树突状细胞来源的装载有IL-4(白细胞介素4) 的外泌体能够缓解小鼠关节炎模型中关节炎的症状，并降低小鼠关节炎的炎症程度。杜氏肌肉营养不良症( DMD) 是一种常见的 X 染色体相关的疾病，一直没有较好的治疗方法。研究人员发现，间充质基质细胞来源的外泌体通过递送 miR-29c，可以增加成肌细胞的分化，同时降低 DMD患者成肌细胞中成纤维基因的表达，在DMD 患者的治疗中有重要的临床应用价值。外泌体载药还被运用到神经元的治疗中，使用骨髓间充质干细胞来源的外泌体装载重组CD63-GFP慢病毒质粒，研究证实了外周神经末梢对外泌体的摄取，以及外泌体可以逆行运输药物到DRG(背根节) 神经元和脊髓运动神经元。该研究提出了一种针对神经元疾病的新的药物递送方法。肝纤维化是一种是由慢性肝损伤期间纤维瘢痕组织过度沉积引起的一种广泛的肝脏疾病。肝星状细胞来源的外泌体递送miR-214 到肝细胞中，能够降低CCN2 蛋白的表达，从而降低肝脏的纤维化。姜黄素是一种黄色 色 素，主要提取于姜黄的根茎中，具有抵抗炎症、促进肠胃蠕动、抵抗恶性细胞增殖、疏风散寒、抗氧化、抗血管生成及保护肝脏、提高肝脏解毒能力等功效。不过姜黄素在临床应用方面存在水溶性较低、体内代谢速度快等问题，因此在机体容易被快速清除。利用外泌体作为包载姜黄素和大黄素的载体，可以天然提高姜黄素和大黄素在机体水环境中的溶解性、稳定性和生物利用度等。此外，血脑屏障是脑部疾病给药的障碍，外泌体以其独特的结构、表面特殊的蛋白，能够穿过血脑屏障，将药物运载到脑组织中。研究表明，载有过氧化氢酶的外泌体可成功通过血脑屏障进入大脑，改善帕金森病的疾病状态。

       参考资料

       [1]张盈盈,陈丽青,刘璇等.外泌体作为药物递送载体的研究进展[J].药学学报,2019,54(06):1010-1016.

       [2]周建芬,柴芝兰,谢操等.外泌体作为药物递送载体的研究进展[J].中国医药工业杂志,2020,51(04):425-433.

       [3]解晓东,练殊.基于外泌体的纳米载体研究进展[J].闽江学院学报,2022,43(05):56-67.

       作者简介：@小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。