长寿之“道”——抗衰老药物研发策略盘点(上)

       抗衰老药物研究简介

       衰老是一个复杂和渐进的生物学过程，涉及每一个器官和组织广泛的慢性改变，并且和多种疾病相关联，衰老学家虽然提出了许多学说，但迄今还不能确定衰老的原因。在过去的几十年里，通过治疗干预措施，极大地提高了人类的预期寿命。相应的，衰老也成为大多数人类疾病的主要危险因素，包括糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病和癌症以及其他老年综合症，如跌倒、虚弱和失禁等。虽然老化是一个不可避免的过程，但研究表明它具有很大的可塑性，其进展速度具有可调节性。近些年有关衰老的机制研究取得了巨大进展，从分子及细胞层面可分为9大标志性事件，如下图所示。这些共同的重要事件主要有基因组的不稳定性、端粒损耗、表观遗传学改变、蛋白稳态丧失、营养状况感知紊乱、线粒体功能紊乱、细胞衰老、干细胞衰竭及细胞间通讯的改变等。

       The Hallmarks of Aging

       自古以来人类便痴迷于延年益寿的各类研究和尝试；而近年来对衰老机理的理解使得对衰老过程进行一定的干预成为现实。三十多年前，daf-2基因被发现能够控制秀丽隐杆线虫的寿命。此后，多种信号通路据报道可直接或间接的影响衰老的表型，如insulin/IGF-1、mTOR、AMPK及sirtuin等。这些发现也直接导致了很多候选药物化合物的发现，通过激活或抑制某些蛋白分子而靶向于多种信号通路。各类抗衰老措施已被用于不同生物体的延迟衰老过程中，包括热量限制、激素疗法、抗氧化补充剂、自噬诱导剂、senolytic类药物、端粒酶的激活、表观遗传学调节等，后者的靶点包括DNA甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶HDAC、组蛋白乙酰基转移酶HAT、非编码的miRNA及潜在的sirtuin激活剂等，尽管很多方法的抗衰老临床疗效尚不确定。本文即对目前相对较为新颖，潜力较大的抗衰老药物研究策略做一简要总结。

       热量摄入限制(CR)及类似物

       Overview of CR-associated signaling and some of its key players

       热量限制(Caloric restriction，CR)指在提供生物体充分的营养成分如必需氨基酸、维生素等，保证生物体不发生营养不良的情况下，限制每日摄取的总热量，又称为饮食限制(Dietary restriction，DR)。McCay等于1935年首次报道CR延长大鼠寿限，迄今70余年来，大量实验已表明CR是除遗传操作以外最强有力的延缓衰老方法，被称为衰老研究领域最重大的发现。同时CR还推迟和降低多种老龄相关疾病如肿瘤、心血管疾病、2型糖尿病等发病。CR已经成为衰老机制及干预措施研究的一个重要模型，并且已有不少研究探索如何在人类实行CR疗法。

       通过热量限制来对抗衰老的作用机制尚未被完全阐明；其潜在的作用信号通路有四条来关联个体的营养状态与促进长寿的效应，分别是AMPK、胰岛素-胰岛素样生长因子1、mTOR信号通路的抑制及sirtuins分子的激活。这些机制主要是直接或间接调控细胞生长、线粒体功能和自噬。对于人类而言，热量限制是一个相当严格的长期干预过程，需要坚定的决心和较强的自我控制能力。初步的人类试验也报告了一些负面后果，如骨质疏松、性欲减退、无法调节体温和丧失体力及耐力等。另外，还有部分学者开展间歇性进食在抗衰老领域的研究。

       能量限制的策略已在很多低等动物开展的实验中证明了其抗衰老效果，但真正在人类身上应用却困难重重；这一矛盾也导致了热量限制类似物CRM的出现。这类化合物可以在实际上没有降低热量摄入的情况下，使体内产生类似于能量限制的效果，从而有利于个体的健康和长寿。CRM方法是抗衰老干预的策略之一。

       葡萄糖代谢及吸收抑制：

       高血糖和高胰岛素血症是老年人常见的两种主要疾病。高血糖引起的氧化应激导致的晚期糖基化终末产物诱发许多退行性疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、慢性肾 脏病和阿尔茨海默病等。有证据表明高胰岛素血症引起的氧化应激会导致氧化蛋白的积累。众所周知，热量限制可以通过降低葡萄糖和胰岛素的循环水平来提高胰岛素敏感性。因此，对于热量限制类似物CRM的开发而言，降低血浆胰岛素及葡萄糖水平是一类有效的策略。

       1998年，糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)开始被认为是第一种热量限制类似物，据报道可以降低大鼠的体温及循环胰岛素水平。2DG是一种葡萄糖类似物，为葡萄糖代谢抑制剂，通过作用于己糖激酶(hexokinase)来抑制糖酵解。该化合物不仅可以增加线虫的生命周期，且对大鼠进行短期摄入后会产生类似热量限制时的表型特征；另外也被发现对于一些神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病典型等是有益的，并减缓缺血导致的脑损伤。2011年，有研究表明2DG可通过线粒体ROS激活的AMPK过程而在培养的表皮细胞中诱导产生自噬。

       尽管文献研究表明热量限制与服用2DG产生的效应类似，但有研究表明摄入含2DG饮食的大鼠会患有肾上腺肿瘤、心脏**并增加死亡风险。其他一些糖酵解酶的抑制剂或葡萄糖摄取阻断剂也有可能成为有效的热量限制类似物，常见的有glucosamine、mannoheptulose及iodoacetate等，作用靶点分别为己糖激酶及甘油醛-3-磷酸异构酶。Acarbose是一类葡萄糖摄取阻滞剂，已广泛应用于2型糖尿病的治疗20多年。该化合物可做用于α-葡萄糖苷酶组织小肠中的淀粉分解为双糖，导致肠内葡萄糖吸收减少，从而造成血液中葡萄糖水平低下的状况。最近的一项研究表明，口服1%的阿卡波糖即可增加小鼠寿命的中位数及值。尽管如此，阿卡波糖似乎具有性别选择性，对雄性的影响比雌性更为明显，寿命增加率分别为22%及5%。另外，实验中还观测到阿卡波糖可以降低体重、血糖、胰岛素和IGF-1水平等效应。

       生长激素/IGF-1信号轴抑制剂：

       Main pathways in endocrine regulation of growth

       近期有研究表明，减少个体的促生长活性同延缓衰老速度、推迟与年龄相关疾病的发病及高龄所带来的风险存在关联性。IGF-1全称为类胰岛素生长因子1，由肝 脏响应生长激素而分泌。大量文献报道了通过基因工程影响GH和IGF-1信号所带来的热量限制效应对延长寿命的影响，包括线虫、果蝇和老鼠等。另外，在小鼠及人体中，降低GH/IGF-1活性可保护机体免于癌症及糖尿病的侵袭，两者均与个体年龄相关。对生长激素释放基因敲除小鼠的研究表明，小鼠个体生存中位数及寿命显著增加，同时显著降低了血清IGF-1水平、体重、血糖、血浆胰岛素、甘油三酯和胆固醇水平，同时伴有血浆瘦素水平、脂联素水平及胰岛素敏感性的上升。而在患有遗传性GH敏感性缺失的Laron综合征人群中，癌症及糖尿病发生的概率大大下降。因此，通过结合生长激素受体而抑制生长激素信号的传递，是延长个体生命的可行性策略之一。

       AMPK激活剂：

       Summary of a selection of target proteins and metabolic pathways regulated by AMPK

       AMPK (AMP激活的蛋白质激酶)是一种保守的异源三聚体蛋白质激酶，其酶活力能够被AMP上调。该蛋白质激酶能够通过感受细胞能量状态来维持真核细胞的ATP生成和消耗的平衡，即能量稳态。同时，AMPK在调控细胞生长和增殖、建立和稳定细胞极性、调节动物寿命、调控生理节律等方面也起着重要作用。AMPK可通过AMP/ATP比例来感知细胞内的能量状态；另外有研究表明，ADP的结合同样有助于AMPK的激活。一旦激活，AMPK即可触发包括糖酵解和脂肪酸氧化在内的ATP合成过程。有意思的是，AMPK的激活也是迄今为止人类了解的最为清晰的mTOR信号抑制效应的胞内触发者。

       近期很多药物已被证明可通过激活AMPK信号通路而对机体产生有益效应。这其中，最有希望的候选药物是****，一类被广泛用于2型糖尿病治疗的药物。****可以降低葡萄糖在胃肠道的吸收，减少肝 脏糖异生并增加胰岛素敏感性。****并不直接激活AMPK，而是通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ活力而导致胞内AMP/ATP比率上升。临床研究及对线虫、小鼠模式生物的研究均表明****对生命体的健康寿命有益。除糖尿病外，****也被报道可降低心血管疾病、癌症及癌症所导致的死亡等风险。这些发现都表明，****是一类理想的抗衰老药物。

       阿司匹林及其代谢物水杨酸是一种常用的镇痛抗炎药，已被证明是AMPK的变构激活剂。阿司匹林是一种乙酰化试剂，可以乙酰化环氧合酶活性位点的丝氨酸残基；该化合物似乎可以降低人类患癌症的风险。据报道，阿司匹林科技增加小鼠的中位数寿命，而不是寿命。在人类结肠癌细胞中，阿司匹林被发现可以抑制mTOR信号和激活AMPK信号通路。阿司匹林对衰老的调节作用使其成为热量限制类似物研究的重要目标之一。

       抑制mTOR信号通路：

       mTOR signaling pathways

       另一种能够感知细胞营养状态并能产生长寿效应的分子为mTOR，分子量约为289kDa且在真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。mTOR家族包括两个蛋白复合体mTORC1和mTORC2，参与调节Akt活性。mTORC1在蛋白的从头合成、细胞自噬及细胞生长过程中扮演重要角色，在细胞内养分充足条件下被激活并与PI3K/AKT、Ras/MAPK及AMPK信号通路互相影响，最终将胞内的营养状态同生长相关过程关联。当环境营养充足时，mTOR关闭应激状态及自噬过程，通过磷酸化4EBPs及S6激酶而激活蛋白质翻译过程。mTOR信号通路的促进长寿作用最早发现于2003年，携带有mTOR突变的线虫寿命几乎翻倍。此后，大量基于线虫及果蝇的研究进一步确认了下调mTOR信号通路对增加预期寿命及产生热量限制效应，改善健康状况的影响。

       雷帕霉素(Rapamycin)是一种免疫抑制药，当人体移植了新的肾 脏或其他器官后，会自然产生排异，而雷帕霉素能抑制这种反应。自1999年美国FDA批准雷帕霉素作为器官移植患者的药物后，迄今已拯救了数以万计移植患者的生命。近10多年来，研究表明雷帕霉素不仅可延缓与衰老相关的疾病，如癌症、心脏病和老年痴呆的病情进展，延长生命，还能推延正常衰老所带来的多种影响。

       真正使人们对雷帕霉素可以延缓衰老留下深刻印象的实验是2009年，一项由美国国立卫生研究院(NIH)资助的大规模研究(由3个著名研究抗衰老单位同时进行)。结果发现雷帕霉素及其衍生品可延长小鼠的寿限，使雄性小鼠寿命延长了9%，而雌性小鼠延长了14%。这是科学家首次证明一种药物能够延长哺乳动物的生命周期。2012年上述3个研究单位在后续的小鼠研究中发现，雷帕霉素能减缓肌腱的硬化速度和肝 脏功能的退化速度，而这两个表征恰恰是衰老的两大标志。2013年有研究报导，雷帕霉素对年老小鼠心脏功能有改善效果。目前已发现雷帕霉素在实验老鼠身上可减少与衰老有关的骨质疏松，逆转心脏老化，并控制慢性病症反应。2015年3月美国华盛顿大学计划对中年宠物狗进行雷帕霉素的小剂量测试，重点将不是寿限(因为那得花很多时间)而是寻找该药对关键性年龄相关指标，如动脉硬化和心脏功能；所产生影响的迹象如果成功，雷帕霉素及其衍生品将最终成为首个抗衰老药物；当然还是限制在狗身上。因为它是一种免疫抑制药，健康人服用它仍存在较大风险，再加上老年人本身免疫功能较低，在没有得出人体安全剂量之前不宜冒险。另外有关雷帕霉素的副作用也已有报道，剂量不当，可能抑制免疫功能，增加糖尿病风险，以及引起口腔溃疡病，延缓伤口愈合等。

       端粒酶的激活

       端粒及在细胞分裂过程中的变化

       端粒酶(Telomerase)，在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延缓缩短端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂的细胞之中，才可以检测到具有活性的端粒酶。

       衰老的端粒酶理论认为，端粒的缩短是刺激衰老发生的分子钟。端粒酶疗法也旨在延长已经缩短的端粒，并且有些药物已经进入了一期临床研究阶段。但端粒酶的另一个作用与肿瘤发生相关，90%的恶性肿瘤利用端粒酶来实现细胞的永生；过表达的端粒酶逆转录酶(TERT)是人类癌症的一个共同特征。端粒酶活化和细胞再生技术已在组织工程和再生医学中得到了成功的应用。

       将端粒长度与衰老联系起来的证据也导致了一种新型抗衰老策略的产生，即寻找能够激活端粒酶活性的分子。这些端粒酶激活剂可以诱导端粒酶基因的表达并激活酶活性，从而维持端粒的完整性。环黄芪醇(Cycloastragenol / TAT2)是一种天然的四环三萜类化合物，在膜荚黄芪提取物中筛选抗衰老活性物质时第一次鉴定得到。实验表明，来源于黄芪的TAT2能够在T淋巴细胞中瞬时激活端粒酶活性。另外一种小分子端粒酶激活剂GRN510已被用于特发性肺纤维化的治疗；而在乳腺上皮细胞和内皮祖细胞中，SIRT1激活剂白藜芦醇可以上调端粒酶的活性。另一种提高端粒酶活性的策略是通过补充抗氧化剂，如银杏叶提取物通过诱导PI3K/Akt信号通路而激活端粒酶。

       自噬诱导剂

       细胞自噬(autophagy)一词来自希腊单词auto-，意思是“自己的”，以及phagein，意思是“吃”。所以，细胞自噬的意思就是“吃掉自己”。细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。细胞自噬主要有三种形式：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)。Macroautophagy的研究最为详尽，它会影响很多生理和病理条件，并在很多重要的生命过程中扮演关键角色。

       The Regulation of Autophagy and Life Span

       细胞自噬的主要保护性功能在于能够去除机体伴随着衰老而积累的一些**物质，后者可引起多种年龄相关的神经退行性疾病。自噬机器还可监测并处理掉受损伤的，膜电位缺失的线粒体。在迄今为止研究的所有实验模型中，自噬都是由相同的信号通路所诱导，这些信号通路都会影响细胞的寿命。mTOR信号的下调及AMPK和SIRT信号的上调会诱发自噬过程的产生，因此自噬水平的降低与加速衰老相关联，而刺激自噬的发生则很可能具有强大的抗衰老效应。在酿酒酵母中，已经证明了雷帕霉素可以通过激活自噬而延长了酵母细胞寿命；相同结果也见诸于线虫和果蝇的研究报道。

       白藜芦醇是一类sirtuin激活剂，被认为在多种实验生物中可通过上调ATG基因的表达水平而发挥促进长寿的作用。而在2016年的一项研究中，研究人员发现亚精胺能够通过改善小鼠心脏功能而促进延长寿命，该效应通过自噬的激活实现。因此，通过药物学手段来改变机体的自噬发生状态，也是抗衰老药物开发的重要策略之一。

       未完待续，敬请期待：长寿之“道”——抗衰老药物研发策略盘点(下)

       缩略词表：

       CR：caloric restriction

       PMRS: plasma membrane redox system

       ROS: reactive oxygen species

       AFR: ascorbate free radical

       GH: growth hormone

       IGF-1: insulin like growth factor-1

       AMPK: adenosine monophosphate-activated protein kinase

       cAMP: Cyclic adenosine monophosphate

       FoxO: forkhead box O

       mTOR: mammalian target of Rapamycin

       PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase

       LC3: light chain 3

       SASP: senescence-associated secretory phenotype

       参考文献：

       1.The Hallmarks of Aging. Cell. 2013June 6; 153 (6): 1194–1217. doi:10.1016/j.cell.2013.05.039

       2.Komal Saraswat & Syed Ibrahim Rizvi (2017) Novel strategies for anti-aging drug discovery, Expert Opinion on Drug Discovery, 12:9, 955-966, DOI: 10.1080/17460441.2017.1349750

       3.Finding Ponce de Leon's Pill:Challenges in Screening for Anti-Aging Molecules. F1000Res. 2016 Mar 29;5. pii:F1000 Faculty Rev-406. doi: 10.12688/f1000research.7821.1. eCollection 2016.

       4.Anti-aging pharmacology: Promisesand pitfalls. Ageing Res Rev. 2016 Nov;31:9-35. doi: 10.1016/j.arr.2016.08.004.Epub 2016 Aug 11.

       5.Longevity-Promoting Pharmaceuticals: Is it a Time for Implementation? Trends Pharmacol Sci. 2016May;37 (5):331-3. doi: 10.1016/j.tips.2016.02.003.

       6.Calorie restriction mimetics: can you have your cake and eat it, too? Ageing Res Rev. 2015 Mar;20:46-62. doi:10.1016/j.arr.2014.11.005. Epub 2014 Dec 19.