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如何成为细胞培养大神?

https://www.cphi.cn   2018-09-13 15:51 来源:生物谷

问世间谁人无忧,唯神仙逍遥自在。作为一名终日泡在实验室的实验君,如何在细胞实验中无所不能,超脱轮回做到一个人人羡慕的细胞大神呢?且看向这里,成为细胞大神的六个细节。

       问世间谁人无忧,唯神仙逍遥自在。

       作为一名终日泡在实验室的实验君,

       如何在细胞实验中无所不能,超脱轮回

       做到一个人人羡慕的细胞大神呢?

       且看向这里,成为细胞大神的六个细节。

       1. 过滤体系

       自从出现瓶装培养基之后,培养基过滤的需求就减少了。有些时候,一些特定细胞培养支持物的添加可能会引入一些新的污染。另外,一般认为,当液体长时间接触瓶口外的空气后最好重新过滤;所以一般不建议 管/瓶 对 管/瓶 的倾倒。这时,很多人会选择Millipore的滤嘴配合针筒进行再过滤。结果发现,完成500 ml培养基过滤后,手疼腰酸!过滤杯的出现完美的解决了这个问题,所以,大体积尽量使用过滤杯吧,可靠且轻松,快捷。

       默克第二代超滤杯

       2. 培养基的选择

       关于血清质量,业界流行的澳洲来源 > 北美来源 >南美来源的说法。这一点从价格上也可见一斑。实际情况是优质血清的市场现实是供不应求,所以很多时候大家就将就了之。如果有好的选择,尽量使用澳洲来源的血清。

       对于培养基而言,情况显然是供大于求的,而且品牌甚多:Sigma,Gibco,Hyclone以及各种国产培养基等,当然一些国外厂商基于竞争及成本的考虑也推出了本土化的培养基。一些人认为培养基能用就行,反正细胞就在那里长着,也没出现大规模的伤亡就忽视了培养基的重要性。但是,实验是对完美的追求,多处将就会导致结果的将就,得不偿失!从细胞培养的实际表现(活力,增殖周期,状态等)看,原装进口培养基 > 进口分装培养基 > 大部分国产培养基。所以,别再将就培养基了!

       如果是因为价格原因而放弃原装进口培养基,现在好的机会来了。Merck/Sigma推出原装进口培养基国产价格,覆盖几乎全部基础培养基。

       3. 支原体检测

       支原体污染和细胞培养机会形影不离,堪称细胞培养的恶梦。前些年有报道说全球超过60%的实验室的细胞存在细胞污染的现象。从早期表现看,支原体污染会让你感觉不到,可能仅仅是细胞增速有些减缓;于是还是快乐的做的实验,结果实验数据不是很理想。事实是,支原体污染会影响细胞代谢,改变细胞功能等。

       药典检测支原体是培养法,时间以周记,这显然不符合科研”快”的需求。PCR法应运而生,Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit,扩增的是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守,因此可检测多达19种支原体。但是PCR后的电泳也是一件麻烦的事情,qPCR就是解决方案:LookOut Mycoplasma qPCR Detection Kit。

       LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit实际效果

       4. 胰酶的使用

       胰酶适合大部多数细胞的消化:HEK293,CHO,HeLa等,而这类细胞我们往往将他定义为“糙”。当然,细胞本身肯定是不糙的,同样相当金贵。只不过这些细胞对胰酶的耐受性好,一定浓度下的胰酶对细胞状态影响不大。

       有些细胞就非常金贵了,堪称“娇嫩”,比如:干细胞/">干细胞等,就不太适合利用胰酶进行消化。另外,如果消化组织进而分离细胞时使用胰酶也是值得小心的。一个好的解决方案是寻找一些温和的替代品:Accutase、Accumax或EZ-LIFT。这些消化剂剂最大的特点是可替代胰酶,消化后无需用血清失活。尤其是EZ-LiFT?干细胞/">干细胞传代试剂,这是一种无酶、化学成分限定的干细胞解离试剂,只选择性传代未分化的多能干细胞,避免人工进行群落筛选或细胞刮铲的步骤,不需要使用ROCK抑制剂即可产生高细胞活性,还可以拯救高度分化的ips细胞培养物。

       5. 细胞计数

       细胞计数是细胞培养的日常。血球计数器、载破片、盖玻片的组合折磨的每一个技术者的眼睛及耐心。所幸的是,一些公司根据血球计数的原理开发出了自动的计数仪,插入装有细胞的盖玻片即可。事实上,基于血球计数原理的另外一个问题是计数的准确性。一般认为CV可能在20%以上,这就非常糟糕了,打算加入10000个细胞,很可能计入了15000个细胞,这是绝对不能接受的。

       另外一个计数方法是基于库尔特原理---类似与流式的方法,将细胞挨个数一遍。看到这个,可能想得是:这么大的一起,这么麻烦怎么做日常计数?Merck的做法是将这个设备小型化了:Sceptor,整体和一把1 ml移液枪类似。15秒内完成细胞技术且CV小于5%。

       细胞计数器Sceptor及其数据呈现形式

       6. 细胞冻存

       细胞传代过程中涉及细胞冻存。这么说其实是很有歧义的,严格意义上说获得细胞系完成检测后第一件事就是大批量冻存细胞,而后开始进行该细胞相关实验。常规来说,一株细胞的使用周期不宜过长,这样能排除反复传代过程中细胞生物学特性的改变。所以,很多时候他人惠赠的细胞系可能会存在传代过多的问题,一个好的方案是从ATCC或ECACC(欧洲细胞库)购买细胞,这些平台的细胞背景干净,传代次数少。

       DMSO是最常用的细胞冻存保护剂,市面上品牌众多,质量参差不齐。如果使用劣质DMSO冻存细胞,可能从实验的第一步开始就已经出了细胞品质不好的问题。推荐使用Sigma的DMSO,较多细胞冻存验证的;或者直接使用其DMSO无血清细胞冻存培养基,确保细胞赢在起跑线。

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