精准肿瘤学的关键目标是改善癌症的诊断和治疗。而对肿瘤样本的一系列基因组和其它分子分析能够帮助发现标志物来帮助选择疗法，预测预后，跟踪肿瘤进化，以及发现不同转移性疾病的分子特征。基于下一代基因组测序（NGS）的分子分析方法已经在肿瘤分析方面得到应用，而综合DNA、RNA、蛋白质和表观遗传特征的多参数综合分析可能更准确地描述肿瘤特征并且帮助发现全新成药靶点。

       目前，精准肿瘤学的焦点愈发转向液体活检，因为它不具侵袭性，而且可以在不同时间点重复进行，从而帮助监察疾病的进展。如今，外周血液中可以被检测的分析物（analyte）包括循环肿瘤细胞（CTCs）；循环无细胞DNA（cfDNA），在癌症患者中它包含循环肿瘤DNA（ctDNA）。其它分析物物包括循环无细胞RNA（cfRNA）；细胞外囊泡（EVs），例如外泌体和肿瘤“教育”的血小板（TEPs）；蛋白质和代谢产物。近日，《Nature Reviews Genetics》 对在精准肿瘤领域液体活检的现状和未来进行了盘点，在今天的这篇文章里，药明康德的微信团队将与读者分享这篇综述的精彩内容。

       ctDNA作为生物标志物的利与弊

       ctDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式，它在具备巨大潜力的同时，在检测开发和临床应用的推广方面也面对着一系列挑战。

       ctDNA作为精准肿瘤学生物标志物的潜力

       研究表明，ctDNA可能由凋亡细胞释放，因此，它只代表了肿瘤细胞的一种特定亚群。尽管如此，ctDNA具有多个优点：

       1. 它能够提供对肿瘤基因组的综合描述，因为ctDNA从多个不同肿瘤区域或多个病灶处释放，ctDNA分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变。

       2. 深度测序可以发现肿瘤内异质性和只在部分细胞中出现的基因突变。这通常需要大量的CTCs或者多次组织活检才能获得同样水平的信息。

       3. ctDNA可以提供肿瘤大小的信息，从而反映出疾病的发展状态和对疗法的反应。研究发现，在非小细胞肺癌（NSCLC）和高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中ctDNA的突变等位基因频率（VAF）与肿瘤体积呈线性关系。

       4. ctDNA还具备预测预后的价值。例如，在旨在治愈的手术或化疗之后，ctDNA的出现是癌症复发和不良预后的有力标志。它预测癌症复发的能力在结肠癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌患者中都得到了验证。

       5. ctDNA分析能够发现肿瘤抗性的标志物，例如，在接受抗EGFR疗法的结直肠癌患者中出现的KRAS突变，以及在乳腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。

       这些优点让ctDNA成为精准肿瘤学应用方面前景看好的分析物。然而ctDNA检测也需要克服血浆中ctDNA水平过低，细胞衰老带来基因变异的影响等挑战。

       ▲组织活检与ctDNA检测特点对比（图片来源：参考资料[1]）

       血浆中低水平ctDNA带来的挑战

       在血浆cfDNA中检测到基因突变的能力与肿瘤负担有对应的关系。但是在不同患者身上的ctDNA水平可能相差很大，虽然他们患上同样类型的癌症。即使是在转移性癌症患者中，也有很大一部分患者血浆中ctDNA的比例异常的少。这清楚地表明，除了肿瘤负担以外，还有其它生物因素影响肿瘤DNA的释放。

       据估算，1毫升血浆中含有大约1500个基因组当量（GE）的DNA片段，通常一次10毫升抽血可以从血样中获得4毫升血浆，意味着能够获得6000 GE的DNA片段。在VAF为0.1%的情况下，在这6000 GE的DNA片段中，平均只有6个DNA分子携带着想要检测到的基因突变，而且随机取样可能会影响这一数值。因此，可靠、准确并且可重复地检测到这些基因突变是一个严峻的挑战。

       检测低水平ctDNA的方法

       如果增加血样体积，可以检测到的分子数目自然会显著上升，但是多抽血的办法通常在晚期癌症患者中无法实现。另外一种克服携带基因突变的分子数目过少的方法是同时检测多种基因突变，然后确定一个基因突变数目的阈值来决定血浆样本是否为肿瘤阳性。例如，有的液体活检可以同时检验患者是否携带18种单核苷酸位点变异（SNV），如果检测到的SNV数目超过2个，则将ctDNA样本定义为肿瘤阳性。

       近年来ctDNA检测技术的开发主要聚焦于增强测序技术的分析敏感度。测序技术的敏感度会受到测序准确性和测序深度的影响。通过使用分子条形码标记被测序的DNA片段，可以提高测序的准确性，从而提高发现基因突变的几率。

       另一种提高敏感度的尝试是富集特定长度的ctDNA片段。有研究表明ctDNA 片段（132-145个碱基对）通常比健康细胞释放的cfDNA片段（~166碱基对）小。因此，富集特定大小的DNA片段进行测序可能提高发现基因突变的敏感度。

       ▲影响循环无细胞DNA检测敏感度的因素（图片来源：参考资料[1]）

       细胞衰老对ctDNA检测的限制

       虽然这些技术的进步能够改善发现低VAF基因突变的能力，但是衰老细胞积累的体细胞突变也会对ctDNA的实用性添加限制。其中一个重要的干扰因素是良性体细胞基因突变随着细胞衰老而增加。在成人干细胞中出现的良性基因突变会随着细胞增殖传给下一代，有的时候在肿瘤驱动基因中出现的基因突变会导致携带这些突变的干细胞增殖速度更快，这可能被误认为肿瘤增生。因此，在肿瘤驱动基因中发现基因突变并不等同于发现癌症。

       ctDNA检测的分析效度和临床有效性仍需确认

       在临床护理中采纳肿瘤生物标志物检测的原则有三条：1. 分析效度（analytical validity），指的是检测的准确性、可靠性和可重复性；2. 临床有效性（clinical validity），指的是检测能够把患者分为不同群体，而且这些群体会有不同临床后果的能力；3. 临床实用性（clinical utility），指的是接受检测的患者的临床后果与未接受检测的患者相比，是否有所改善。

       目前，市场上的ctDNA 检测的结果一致性和临床有效性还未得到完全确认。有研究使用两种不同的ctDNA检测方法对同一批样本进行检测，试验结果表明，在34个接受检测的样本中，只有9个样本在两种ctDNA检测中给出了完全一致的结果。这种数据让人对这些检测的分析效度和临床有效性产生疑虑。目前，业界需要进行多中心研究，使用足够大的患者群来确认ctDNA检测的分析效度和临床有效性。

       而且，检测的标准操作程序和指导需要得到统一。欧洲标准化委员会（CEN）已经发布了处理和纪录用于ctDNA分析的血样的标准程序。其它国际组织也在致力于将液体活检的流程标准化。如果想将基于NGS的液体活检在临床中广泛推广，它们必需接受完备的检验并且通过基于确认标准的质量检测。