新闻事件

       最近化学生物学大牛Cravatt发表了一篇用分子片段在细胞水平、蛋白组范围为多个蛋白寻找小分子配体的工作。作者用8对互为对映体的小分子片段作为探针、设计了16个（8对对映体）所谓完全功能化片段（FFF）。这些FFF由三部分组成，除了与蛋白结合的探针片段外、还有一个在紫外光照下可以与蛋白质反应的双吖丙啶和一个可以与叠氮在生物环境下高效反应的炔基。分子片段与蛋白结合后增加这些蛋白被双吖丙啶降解后形成卡宾捕捉的几率，被捕捉蛋白再通过点击反应被捞出，然后通过荧光或质谱鉴定是哪些蛋白没能抵制住FFF的诱惑。

       作者用这些FFF在PBMC和HEK293两种细胞中钓鱼，找到176个能与至少一个小分子片段结合的蛋白。这些找到新配体的蛋白有些有已知的小分子配体，作者证明这些已知配体（通常是活性腔配体）可以与这些片段竞争，说明这些片段并非与功能无关的结合腔结合。因为这些FFF与蛋白形成了共价结合物，所以分析FFF接在降解后蛋白的哪个多肽上也可以佐证结合腔。作者只用了8对对映体就为176个蛋白找到心仪配体，如果扩大FFF范围有望为多数蛋白找到小分子配体、也可以根据成功率定义某个特定蛋白的成药性。

       药源解析

       这个工作涉及新药发现早期阶段的几个重要方面、其FFF设计和用到的分析技术也很巧妙，值得解读一下。靶点的成药性是新药发现立项的一个关键考虑，如果事先知道一个靶点成药性很差厂家则可以放弃在筛选上的过度投入、避免浪费太多时间和资源。当然有些与疾病高度相关、但成药性差的靶点如KRAS制药业明知山有虎偏向虎山行是另一回事，成药性这个信息还是十分关键的。这个工作如果扩展可能在蛋白组范围为多数蛋白的成药性分层。很多蛋白没有已知小分子配体，为蛋白找到一个可以在细胞环境下结合的先导物是药物优化的第一步。在一定程度上这176个蛋白已经有了苗头化合物。

       这个工作的基本思路早就有了，但是细节上作者做了重要改进。分子片段因为比较小所以与任何蛋白结合都不会太强、选择性也不会太好，作者定义的选择性结合是两个对映体捕捉的同一蛋白相差2.5倍以上。之所以比较对映体是因为卡宾化学反应活性极强、即使探针没有与蛋白结合或者非特异结合也会通过随机分子间碰撞捕捉住一些蛋白。而细胞内不同蛋白的表达量差很多，所以高表达蛋白按概率也会更多被捕捉。但因为蛋白结合腔通常是手性环境，所以对映体之间的差别可以作为排除非特异结合的一个指标（如果两个对映体捕捉同量蛋白说明特异性结合没有起到关键作用）。所以通过这个程序捕捉的蛋白并不一定是结合力最强的蛋白、也不一定是被捕捉量的蛋白，因为如果结合腔不能区分探针手性无论结合力多强都会被当作噪音（对映体之间无差别）被去掉。这是这个工作设计上的一个重要改进。

       通常一个靶点要找到有用的小分子配体都得筛选上百万的化合物库，他们怎么只用16个片段就筛选了整个蛋白组、并为176个蛋白找到了配体了呢？当然原因是探针浓度的慷慨和结合强度的容忍。探针浓度在20-200 uM之间，而因为筛选的阳性标准是化学反应速率较小的差别（2.5倍）、所以对结合强度要求可能非常低。另外捕捉蛋白量的不同也可能是对映体结合力相同但卡宾与蛋白C-H的插入反应速率有差别，但作者认为这也是个有用信息。即使如此作者只用8对对映体就捕捉了176个蛋白还是很高效，尤其考虑到80%的蛋白只与一个探针结合，说明结合有一定选择性。这些探针都是结构比较相似的氨基取代芳香化合物，是GPCR受体的所谓优势骨架，但这176个蛋白中GPCR并不多。很多与这些化合物结合的蛋白是酶，但也有一些比较难成药的蛋白如转录因子。

       除了设计这个工作中用的一些技术也很巧妙。多数能令蛋白C-H键参与的化学反应都需要酸碱催化、或高温、或需要有机溶剂，在pH7室温水溶液中能与天然蛋白加成的反应半只手就能数过来。打捞被捕捉蛋白的点击反应知道的人很多，但不一定有很多人理解Sharpless从茫茫人海中找到这个不起眼的古老化学反应需要的功力。从看着就像千里马的马中找到千里马容易，但从长相普通的马中找到千里马要看手艺。因为捕捉蛋白富集比例只有几倍，所以准确分析很重要。他们把细胞分成两份、分别用两个对映体处理，但其中一份用同位素标记的氨基酸培养。分析时把两份细胞混合起来做高通量质谱、这样就知道哪个蛋白来自哪份细胞。同样也可以用同位素标记的甲醛衍生化捕捉蛋白，而另一个更高通量的分析方法准确性也足够可靠。

       制药工业中这个体系更经常用于候选药物在细胞内与靶点的结合确证。在纯化蛋白有活性的化合物需要有在细胞环境下与靶点蛋白相互作用的证据，否则会成为一个开发风险。这个数据虽然不一定必须要有，很多上市药物当年没有这个数据。但靶点关联类似探险的地图，虽然没有地图你也可能找到宝藏并安全返回、但牺牲在路上的风险大增。

       找到一个能与蛋白结合的探针只是万里长征第一步。这样小的配体要优化成可以作为药物使用的分子需要很长时间，通常需要有蛋白晶体结构的指导、否则难度太大。足够活性的化合物找到后可能在动物模型中无法重复基因学研究结果、或者**太大。即使一切顺利进入临床也只有5-10%的可能上市、有1-2%的可能成为公司可以依赖的大产品。这个工作虽然非常出色，但只相当于登山从大本营出发、与登顶还相隔无数磨难。药物发现就是这么难。

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