• 产品
  • 供应商
  • CAS号
  • 采购
  • 资讯
  • 会展活动

热搜关键词: 中国制药网 阿尔兹海默症 熊去氧胆酸胶囊 玉米淀粉 硫酸庆大霉素 >>

您的位置:首页 >> 资讯 >> 生物制药 >> SMN 2基因mRNA前体剪接调节剂开发:表型筛选与优化实例

SMN 2基因mRNA前体剪接调节剂开发:表型筛选与优化实例

https://www.cphi.cn   2019-03-12 13:59 来源:药渡

SMA是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,常见于婴幼儿,主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等,大部分患儿在不到两周岁时死亡,幸存者也会在成年后丧失大部分运动能力,需要在轮椅上生活。反义核苷酸Nusinersen是目前唯一获批可用于此病的药物。

       SMA是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,常见于婴幼儿,主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等,大部分患儿在不到两周岁时死亡,幸存者也会在成年后丧失大部分运动能力,需要在轮椅上生活。反义核苷酸Nusinersen是目前唯一获批可用于此病的药物。

       人类的SMN基因有两种:SMN 1和SMN 2,两者都位于5号常染色体,且非常相近,其编码的SMN蛋白若缺失,会导致脊髓中的α神经元死亡,引起脊髓型肌萎缩。SMN蛋白主要由SMN 1基因表达,当其缺失或突变体纯合时,SMN 2基因能部分抵消其产生的缺陷,但SMN 2基因中一个碱基异位突变时,造成其转录的mRNA前体在剪接时容易丢失7号外显子,因此只能产生10%-20%的正常SMN蛋白,造成SMA。目前对SMA的治疗除上述提及的反义核苷酸Nusinersen外,也有通过基因替换或小分子调节的方式,但都还处于研究中。脊髓性肌萎缩症在人群中的携带率约为1/35-1/50左右,发病率约为1/6000-1/10000左右。

       Hit compound的发现

       由于SMA是一种典型的信使RNA前体剪接异常造成的关键蛋白表达障碍,而mRNA剪接过程较为复杂,涉及到多个因素,因此Novartis采用高通量表型筛选技术,以期能够得到可调节SMN 2基因RNA剪接的小分子化合物。

       在NSC34运动神经元细胞系中运用Minigene技术作为筛选方法,对大约1.4ⅹ106个化合物进行筛选,不到1%的化合物有响应,以哒嗪为核心骨架的化合物表现出较好的效果,得到代表性化合物1。化合物在高通量测试条件下,EC50=3.5 μM,相比DMSO的控制组,SMN 2 报告基因信号增强了1700%,在小鼠的SMN ELISA测试中,EC50 = 0.6 μM,SMN蛋白表达水平提高了2.5倍,在人类SMA患者的细胞模型中,SMN蛋白表达水平提高了1.5倍,但是该化合物的血浆清除率较高,口服生物利用度也仅有18%,而且还存在hERG抑制活性,因此需要进一步的药物化学优化。

       化合物优化

       在对化合物进行药物化学优化前,分析其结构可知,1以哒嗪环为中心结构,左侧是一个苯并噻吩的芳环结构,右侧通过一个杂原子(胺)与哌 啶环相连,因此在进行优化研究时,可按照上述的分析进行优化。

       在芳环体系的优化中,将CH衍生为N或者变换N的取代位置,常常会对化合物的活性以及理化性质产生非常明显的效果!早期的哒嗪环含两个邻位的氮原子,将氮原子变换位置和删减,并未获得较为理想的结果,此外,将六元环调整为五元噻唑环,活性表现降低。在哒嗪环上进行甲基取代优化中,发现4位取代的活性要高于5位取代,但是活性还是低于无取代。

       哒嗪核的优化结果显示,保留其起始结构是选择,在对右侧四甲基哌 啶的结构进行优化时,降低哌 啶环的亲脂性将会引起活性的下降,而将碱性的哌 啶环用醚环取代,如呋喃,发现活性完全丧失,不过这两种修饰方式都能降低hERG结合活性,由上述结果可知右侧四甲基哌 啶环的碱性和亲脂性是化合物是提高SMN蛋白水平的重要因素,而连接哌 啶环和哒嗪核的linker,用醚键替代效果类似。

       左侧的苯并噻吩环在优化时,发现耐受性较好,能够容忍多种芳环、芳杂环的取代,因此该位置不仅可以用于优化化合物的活性,还可以调整化合物的理化性质和ADME特征。初步优化时,将苯并噻吩替换为噻吩,发现化合物活性丧失,而用苯并噻吩的电子等排体2-萘(6)取代时,活性保持,而1-萘基(5)则活性下降,主要是因为不能与哒嗪核保持一定的共平面性。当芳环邻位有取代时,大部分化合物活性丧失,但是当芳环邻位有羟基取代时,活性得到增强,但是也会造成较强的hERG抑制活性,将羟基用甲基封闭后,活性降低了近50倍!

       分析上述结果,左侧芳环与哒嗪核的共平面性是决定活性的关键因素!对化合物4和其甲氧基取代化合物4-OMe的单晶结构分析,发现前者萘环平面与哒嗪环平面的二面角远小于后者,主要是因为羟基和哒嗪环中的氮原子形成氢键作用,而当羟基被替换为甲氧基后,氧的孤对电子与哒嗪环上的氮原子孤对电子的排斥作用,导致二面角增大,表现为活性降低或者丧失!

       经过初步的结构优化后,将得到的几个体外活性较好的化合物,如化合物2、3和4进行体内实验,以确认优化成果,具体数据如表格所示。化合物2与1相比,只是将linker加了一个甲基,虽然对清除率影响不大,但是提高了化合物的血脑屏障透过率,主要是因为其减少氢键供体的数量,除此之外,化合物2的AUC以及生物利用度得到了明显的提高,基于上述发现,保留linker的甲基化是合理的!对比上述三个化合物,选择化合物3进行进一步的体内活性效果研究。

       以SMN delta7的小鼠为模型,不同剂量下SMN蛋白的表达水平呈剂量依赖关系。采用三种不同剂量的化合物喂服模型小鼠,其存活时间明显提高,但30 mg剂量下的总体表现低于10 mg剂量下的总体表现,表明化合物3存在一定的耐受性问题,例如其较高的hERG结合活性。

       将3中的氰基用不同芳杂环取代,发现其修饰的耐受性较好,用吡唑替换后(7),活性略有提高,但是显著降低了脱靶**,将linker用氧原子替代后,虽然活性未发生多大变化,但在SMN ELISA测试中,SMN蛋白表达水平略有提高,但是都未能改善hERG。

       在前期对右侧哌 啶环的优化中,发现活性与其碱性和亲脂性密切呈正相关,然而在生理pH条件下,与疏水中心邻近的质子化胺结构是造成hERG结合活性的重要因素,因此,降低亲脂性以及pKa就成为了首选优化策略!以化合物7为模板,对右侧的哌 啶环进行修饰,均未能得到较好的结果,在改善hERG的情况下,活性也会损失!对左侧芳环引入一些极性基团,如将萘环替换为喹啉或异喹啉、吡唑连接位置调整、在吡唑上引入氨基、羟基等基团等,在活性保持的同时,也降低了hERG结合性,但由于部分化合物PSA的增大,导致透过性降低,如8和12,由于氨基的引入,10的生物利用度仅有4%。化合物9和12的PK数据较为平衡,但是在SMN ELISA测试中,SMN蛋白表达水平只提高了2.6倍,而SMN表达效果的为12,有3.1倍之多。

       将化合物12的linker采用氧、亚甲基等替换,亚甲基(13)活性降低,但hERG结合性大有改善,氧取代和氮甲基取代,hERG性质类似,但氧取代的SMN蛋白表达水平(3.6倍),此外,氮甲基取代时(12)膜穿透性较差,因此优选氧取代化合物进入到临床阶段的,目前正在I/II期临床研究,预计2020年完成!

       总 结

       mRNA前体的剪接是真核生物中基因表达的关键步骤。异常剪接会引起蛋白质的结构和功能改变,是疾病发生的一个常见原因。据文献报道,大约1/3的致病变异会引mRNA的异常剪接,基于Minigene技术的表型筛选方法,为攻克此类疾病的治疗提供了重要的方法,通过表型筛选得到理想的化合物后,再利用相关技术确认作用靶点,此类策略是开发First in class药物非常有效的方法。在化合物的优化过程中,优化化合物构型、调整亲脂性以及碱性,不仅会影响到化合物的ADME,而且是改善hERG性质的重要方式。

点击下图,预登记观展

b2bcnbjzixun

如果这篇文章侵犯了您的权利,请联系我们。

市场动态更多 >>
主编视角更多 >>
热门标签更多

投稿合作联系方式: Kelly.Xiao@imsinoexpo.com 021-33392297

地址:上海市徐汇区虹桥路355号城开国际大厦7-8楼 200030

CPHI 网上贸易平台: CPHI.cn| Pharmasources.com| CPHI-Online.com
客服热线:  86-400 610 1188 (周一至周五 9: 00-18: 00)