工艺设备中生物膜的形成会导致后续GMP生产中的一系列问题。工艺设备表面由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌和细菌孢子等组成的生物膜会影响到使用此设备生产的产品的安全性、成分、规格、质量和纯度，并可能进一步导致产品污染、危害消费者从而受到法规惩罚。

       FDA关于微生物污染的法规如下：

       对于非无菌药品生产，需要设立并遵守适当的书面操作流程以预防有害微生物污染。

       对于无菌药品生产，需要设立并遵守适当的书面操作流程以预防有害微生物污染。此类操作流程需要包括所有无菌和灭菌工艺的验证。

       如下文中的例子，产品的微生物污染通常会导致召回。

       这家公司声称其在2017年8月1日至2018年4月生产的产品中，有一"小部分"微生物污染检测结果为阳性。2018年7月，这家公司宣布因为在FDA例行检查中发现有布氏假单胞菌、荧光假单胞菌和多噬伯克霍尔德氏菌污染召回4个批次的产品。

       FDA法规和上述产品召回的案例证明微生物污染对于药品生产者和监管者而言都是明确的关注点。任何在生产现场发生的微生物污染问题都需要用适当和彻底的调查以及强有力的纠正和预防措施来处理。

       本文将会阐述生物膜的生命周期、可能会引起生物膜形成的条件或因素以及生物膜问题处理的方法。这些内容可以帮助药品生产者前摄性地采取适当的操作流程以尽可能减少生物膜污染的风险。

       生物膜的生命周期

       微生物一般是浮游性的，例如在培养基中根据代谢和生产特性处于未贴壁或自由悬浮状态。最近的研究发现微生物也可以在材料表面附着、生长，形成复杂的微生物群落。这一现象引发了后续关于表面附着微生物（生物膜）性质的研究。

       生物膜到底是什么？一般认为，生物膜是由多种微生物组成的生物群落，其外包被有黏滑的、由多糖、核酸和蛋白组成的结构复杂的"胞外多聚物基质"。

       以下是生物膜生命周期的三个主要阶段：

       Diagram 1: Biofilm Lifecycle

       第一阶段：附着

       自由浮动的或浮游的细菌细胞在潮湿环境下可以附着在材料表面并开始分泌被称为胞外多聚物基质（EPS）的黏滑、胶状基质。附着在表面的微生物可以是单一种属，也可以由多种细菌、真菌、藻类、酵母、原生动物或其他微生物以及细胞碎片和腐蚀产物组成。

       第二阶段：生长

       在胞外多聚物基质的保护下，生物膜可以快速成长为具有复杂三维结构的群落，视环境条件从若干层细胞到几英寸厚不等。

       第三阶段：脱落

       生物膜生长成熟后，大小不等的细胞团块和碎片可以从其三维结构上脱离，使得原群落中的细菌可以散播并附着到下游的其他表面或生物膜群落上。

       生物膜污染经常反复发生。短时间内污染问题可能表现为受控状态。但是如果针对生物膜的去除和处理措施不够有效，一段时间后仍然可能发现污染。

       形成生物膜的影响因素

       下文的表2列举了一些工艺设备中可能会导致生物膜形成的因素。

       设备/工艺：管道中流速小于1.5 m/s会增加微生物附着在管道表面的可能性。死角是指工艺设备中一些液体容易潴留且不易和清洗剂和水充分交换的部位。长径比（L/D）大于1.5的死角易形成潴留液体、积累残留或微生物。非卫生级阀门易积累残留且不易清洗，通常建议使用卫生级阀门如隔膜阀或夹管阀。管路的不适当坡度会影响排水能力，从而增加液体潴留在系统中的可能。通常建议的管路坡度为0.5% - 1%（每1米下降0.5到1厘米）以保证排水能力。

       表面粗糙度：通常用Ra，即轮廓算数平均偏差来衡量某一材料的表面粗糙度。不锈钢表面的腐蚀会增加其表面粗糙度。在此情况下，其表面会更不容易清洗。因此常规的清洗操作流程有可能不能有效去除粗糙表面的残留。而这些产品残留会给生物膜的生长提供良好的条件。

       残留：开发清洗工艺（包括使用合适的清洗试剂、时间、清洗剂浓度和温度）时需要考虑的重要因素。开发出来的清洁工艺必须证明能够持续有效地去除产品残留。产品残留除了会影响杀菌或灭菌工艺的有效性，同时也为微生物生长提供了营养源。

       Diagram 2: Factors leading to Biofilm Formation

       生物膜问题处理

       工艺设备中生物膜问题存在的最初信号之一是微生物检测中频繁发生微生物超标。胞外多聚物基质（EPS）保护了生物膜中的微生物并增加了其对于杀菌和清洗工艺的抵抗能力。如果一家工厂遭遇了反复发生的微生物污染事件，其首要任务是确定和彻底清除微生物污染的来源。关于生物膜问题经常问到的问题是："如何彻底清除生物膜？"

       一旦在系统中发现有可能的生物膜问题，需要采取生物膜处理措施以去除生物膜残留并同时对整个设备进行灭菌。这类处理措施通常可以分为三步。

       使用碱性配方清洗剂以穿透EPS并使EPS失活。配方清洗剂中的表面活性剂能够有效地穿透EPS并使EPS失活。去除EPS保护层对彻底清除生物膜非常重要。

       不锈钢表面的腐蚀或红锈经常伴随生物膜问题一同存在。在这种情况下，需要对腐蚀/锈蚀表面进行除锈和钝化以修复不锈钢表面的钝化膜。如果没有发现红锈问题则可以省略这一步。

       使用杀孢子剂或高温蒸汽对整个系统进行灭菌

       这一步通过使用杀孢子剂（例如过氧化氢/过乙酸混合物、异丙醇、乙醇或高温蒸汽灭菌）彻底清除工艺系统中残存的微生物。

       美国环保署（EPA）有两种标准测试方法来评估消毒试剂对于两种易形成生物膜的微生物（绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的效力，并同时作为这些产品标签声明的法规指南。如果一家消毒产品供应商希望在其广谱消毒剂的标签上添加硬质无孔表面去除生物膜的声明，这些测试方法和指南为其提供了一个框架。

       在生物膜问题处理策略中，通常推荐使用标签上带有生物膜去除声明的广谱消毒剂。

       预防性措施

       俗语有言："一份预防胜过十分治疗"。通过以下措施前摄性地预防生物膜的形成是更好的策略。

       工艺设备的易清洗性。工艺设备的工程设计应考虑到易于清洗，如卫生级设计和配件。

       使用合适的清洗试剂和清洗参数有效地去除工艺设备上的残留。

       使用酸性清洗剂定期进行不锈钢设备的维护。

       优化清洗/杀菌频率以保持设备处于洁净状态。

       对于收集到的微生物数据进行例行的趋势分析可以帮助管理者知晓工艺系统微生物控制的状态以及对于不良趋势可以采取早期介入。

       结论

       理解生物膜的生命周期、特性和处理方法十分重要。此外，制药、生物制药和医疗器械生产工艺中的生物负载控制取决于多种因素。这些因素包括有效的清洗工艺、良好的工程设计、定期的设备维护程序和持续性的检测和趋势分析。这些预防性的措施可以尽可能减少生产设施中的微生物污染风险，确保任何生产出来的药品对患者和消费者都是安全的。

       参考文献

       1) Pharmaceutical Technology Editors (Aug 22, 2018), King Bio Recalls Products Due to Microbial Contamination (http://www.pharmtech.com/king-bio-recalls-products-due-microbial-contamination)

       2) Lopolito, P., and E. Rivera. "An Audit Approach to Address Microbial Contamination in Process Equipment." In Contamination Control in Healthcare Product Manufacturing, 2013, co-published by PDA and DHI

       3) Cleanroom Technology, Strategies for Biofilm Remediation, A. Deal, D. Klein and P. Lopolito Jul 2015.

       4) STERIS internal document, Tech Tip #3088 - General Cleaning Recommendation for Removal of Microbial Residue

       作者简介：

       Richard Chai

       技术服务经理

       史帝瑞生命科学

       Richard Chai先生（以下简称Richard）目前任职史帝瑞技术服务经理，致力于为客户提供洁净室清洁和微生物污染水平控制相关的技术培训（包括消毒剂验证、产品接触表面的清洁和清洁验证）。他同时还是ISPE会议的讲师。

       加入史帝瑞之前，Richard有过13年在干粉吸入器、生物无菌灌装和包装、医疗器械和生物医药设备制造和验证相关的工作经验，因此对洁净室的清洁和消毒要求、微生物污染水平控制的方法有深入的理解。Richard曾担任过验证咨询专家，对许多制药客户在设备验证、产品接触表面的清洁验证、消毒剂验证和产品接触/非接触表面的清洁等方面提供验证技术支持。