新型冠状病毒肺炎疫情在国内已逐渐平稳，全球疫情却正处爆发期。当各国不得不开始重视起疫情的控制时，首先要解决的就是新型冠状病毒的检测问题。回顾国内的抗疫历程，我们很早就确立了核酸检测作为新型冠状病毒肺炎的诊断金标准，但曾有很多临床医生强烈反映核酸检测出现了“假阴性”的情况，即对于一些临床、影像学和流行病学特征都高度提示新冠的患者，核酸检测结果却为阴性，甚至有的患者需要3次以上核酸检测才第一次返回阳性结果。要理解并解决“假阴性”的问题，我们需要对新型冠状病毒的检测原理和过程有一个基础的了解。

       一、新型冠状病毒核酸检测，到底在检测什么？

       新型冠状病毒的检测目前有2种方法，第一种是核酸检测，第二种是抗体检测。核酸检测的对象是病毒的RNA，抗体检测的对象是机体在免疫过程中产生的与病毒蛋白特异性结合的抗体。

       RNA可以理解为病毒的遗传密码，是由数万个密码子连接而成的单链密码串。对RNA的检测实际上只需要选择这长串密码中特异性的位点，如果特异性位点中的密码序列符合，那么就可以确认标本中存在新型冠状病毒。实际检测中，现有的核酸检测都是检测DNA的，所以在对标本处理得到基因组RNA之后，往往需要将RNA逆转录为互补的cDNA。荧光RT-PCR是目前使用最广泛的新型冠状病毒核酸检测方法，因其具有优异的灵敏度和特异性并且快速简单成本低。荧光RT-PCR的原理是首先把cDNA在PCR反应体系中进行扩增并使用荧光进行标记，每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子产生（图2）。通过测定荧光达到一定阈值所需扩增循环数（Ct 值）来实现靶标定量检测。初始靶标核酸的浓度越高，Ct 值越小。由于SARS-CoV-2属于RNA病毒，容易发生变异，为防止错检和漏检，PCR检测一般会分别在ORF1ab基因、N基因选取2个靶标，有时还会在E基因上选取第3个靶标，以提高SARS-CoV-2的阳性检出率。

       全基因组测序是新型冠状病毒检测的另外一种核酸检测方法。对病毒进行全基因组测序 可以帮助我们了解病毒的遗传信息，最初新型冠状病毒的鉴别就是通过基因测序进行的，测序结果可以用于指导核酸检测产品（如荧光RT-PCR）的设计，并对病毒进行追踪和溯源。测序技术的最大优势在于高敏感性、高准确性，但测序技术由于仪器成本较高，依赖于专业人员对序列的解读，且检测时间较长，目前还不适用于大规模检测。此外，其他核酸检测方法还包括液滴数字PCR，基因芯片等，这些核酸检测方法可以进一步改善检测的效率和精度，但由于设备和操作流程要求较高，也不适合紧急疫情期间的大规模应用。由于RNA病毒容易发生变异，为防止错检和漏检，用于SARS-CoV-2检测的PCR检测一般会分别在ORF1ab基因、N基因选取两个靶标，有时还会在E基因上选取第3个靶标，以提高SARS-CoV-2的阳性检出率。

       新型冠状病毒抗体检测原理是基于抗体与抗原的特异性结合这一特性，抗体是人体免疫系统产生用于对抗抗原的物质。在人体感染SARS-CoV-2后，病毒会作为抗原刺激人体免疫细胞产生抗体，因此可以通过检测人体内是否产生特异性的抗体来间接检测是否感染SARS-CoV-2。检测的抗体主要分为免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）两类。lgM是机体初次免疫应答产生的抗体，一经感染，立即产生，但持续时间不长，主要作为早期感染的指标。lgG是机体再次免疫应答产生的抗体，产生时间晚，持续时间长，主要作为感染和既往感染的指标。一般认为在发病7天后体内才开始出现IgM抗体，发病15天后开始出现IgG抗体。同时检测lgM、lgG抗体可以提高检测的准确性，减少漏诊。抗体检测的样本主要是血清、血浆或全血。目前使用最广泛的新型冠状病毒抗体检测方法为免疫色谱试纸条，其原理为预先在试纸条的检测线（T线）上固定抗体（抗原检测）或抗抗体（抗体检测），在控制线（C线）上固定二抗，结合垫带有免疫标记的探针。一般探针为胶体金、乳胶粒子或荧光微球等具有比色或荧光信号的微颗粒。在样品垫中加入待测样本，样本流至结合垫时，通过抗原–抗体相互作用与探针结合，形成样本–探针复合物。当流动至T线时，复合物会被T线上的抗体或者抗抗体捕获，形成标记三明治夹心结构复合物，使T线显色。T线和C线同时显色表明待测标本中含有病毒的抗原或者抗体，只有C线则表明无病毒抗原或抗体。免疫色谱试纸条法无需复杂的仪器，操作简单，可直接目视判定结果，检测时间只需十几分钟，适合于现场快速筛查。但其准确度和灵敏度有限，可以作为新型冠状病毒检测的辅助方法。

       二、核酸检测为什么是诊断金标准，“假阴性”如何解释？

       核酸检测之所以是新型冠状病毒肺炎诊断的金标准，是因为核酸检测在本质上是一种病原学检测，即在标本中检测到了SARS-CoV-2特有的基因片段，那么除非标本被污染，可以肯定患者存在SARS-CoV-2感染。目前严格执行"三个阴性样本随机放在临床标本中间同时参与检测全过程"的质控策略，可以有效而及时地识别出标本被污染的情况。临床医生曾反映强烈的核酸检测"假阴性"概念，往往指的是患者的临床症状及影像学证据高度疑似新型冠状病毒肺炎，但2019-nCoV核酸检测多次或始终为"阴性"。而对于检验实验室而言，假阴性指的是所采集标本中存在有足够量的病毒，但却没有被检出。导致“假阴性”的可能原因包括：

       被感染者细胞内的病毒量不足：不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同，例如感染初期可能体内病毒量较低而无法检出；不同部位中，肺泡灌洗液中最容易检出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

       标本采集时未采集到含病毒的细胞：采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够；采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等，则可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞。

       检测试剂的可靠性不足：任何一种检测试剂的检测范围都存在下限，病毒数量低于检测下限时是无法检出的。此外，若原始标本中病毒数量低于一定程度，就很可能在核酸扩增检测的反应体系中没有病毒核酸，试剂也就无法检出。

       实验室质量控制不规范：例如未严格遵守标本运输的温度和时间要求，检测操作或者结果判读不严谨等。

       根据中华医学会检验医学分会发布的《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》，新型冠状病毒检测阳性结果的报告要求满足以下任一条：（1）ORF1ab和N基因同时阳性时，判定为阳性；（2）若仅ORF1ab或N基因其中之一检测结果阳性时，需重新提取原标本的核酸进行复查，复查后ORF1ab或N基因仍为阳性时，判定为阳性。阴性结果的报告要求为两个位点扩增结果都无反应。其余情况都认为“可疑结果”，需要换用不同厂家或者敏感度更高的检测方法进行确认，并建议建议临床重新采集标本或更换部位采集标本再次检测。对于核酸检测报告的阴性结果，需要结合患者的临床特征进行综合判定，如果患者的症状、流行病学和胸部CT表现都高度提示感染时，很可能是因为标本中病毒量低于检测下限而未被检出，该情况下建议重新采集标本或者更换标本采集部位后再次检测。

       三. 目前已有哪些可商用的新型冠状病毒检测试剂？

       截至目前，国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂11个，抗体检测试剂8个（如图4）需要注意的是，正常情况下一种检测试剂在临床应用之前都需要进行性能验证，以确保检测试剂的性能可以满足临床需要，但疫情突发，已获批的所有新型冠状病毒检测试剂都是属于应急审批，所有的检测试剂产品都未经过充分的性能验证。即便如此，通过应急审批的检验试剂也很大程度地满足了国内新型冠状病毒肺炎诊断的需求。此外，在保障我国病毒检测需要的基础上，已有越来越多的国产冠状病毒检测试剂获得欧盟认证或经NGO机构进行捐赠，驰援全球。

       参考文献：[1]国家卫生健康委办公厅.新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）. 2020年3月3日印发.

       [2]Lu R, Zhao X, Li J, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020;395(10224):565–574. doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8

       [3]董召刚, 邹明瑾, 张义. 新型冠状病毒肺炎核酸检测现状及研究进展 [J/OL] . 中华检验医学杂志,2020,43 (2020-03-05).http://rs.yiigle.com/yufabiao/1183778.htm. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200226-00128.[网络预发表].

       [4]中华医学会检验医学分会. 新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识 [J] . 中华医学杂志,2020,100( 00 ): E003-E003. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0003

       [5]张瑞, 李金明. 如何减少新型冠状病毒核酸检测的"假阴性" [J] . 中华医学杂志,2020,100( 00 ): E008-E008. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0008

       [6]王露莹,陈品儒,郑国湾,漆楠,杨科.新型冠状病毒检测方法的研究进展[J/OL].现代药物与临床:1-5.

       [7]澎拜新闻. 首先质量要过关！首个新冠病毒检测试剂盒诞生全程复盘. 来源：https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_5754281

       [8]第一财经. 共击疫情，中国新冠病毒检测试剂盒驰援全球.来源：https://www.yicai.com/news/100561666.html

       （注：原文有删减）