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       简介

       COVID-19的大流行把mRNA**推向整个生物药行业的C位，ioNTech/ Pfizer，Moderna已经上市，在欧美广泛接种。值得注意的是二者的递送系统均为脂质纳米颗粒。**开发的速度也超出了预期，这些结果仅在SARS-CoV-2序列公开发布后10个月才出现。

       与其他药物形式（包括小分子，DNA，寡核苷酸，病毒系统和蛋白质，包括抗体）相比，mRNA治疗剂具有许多优势和若干挑战。与DNA相比，mRNA仅需要进入细胞质核糖体翻译，而无需进入细胞核，因此不存在基因组整合的风险。与蛋白质和病毒系统相比，mRNA的生产过程无细胞，速度更快，并且蛋白质产物具有天然的糖基化和构象特性。当与脂质纳米颗粒（LNP）输送系统结合使用时。

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       技术平台开发中的主要挑战因素

       自身的免疫原性、对酶促降解的敏感性导致不稳定、裸mRNA难以被细胞摄取。mRNA的固有免疫原性归因于细胞通过Toll样受体（TLR），激活免疫系统，尽管这种激活可能有助于增强对mRNA**的免疫反应，但直接的作用是通过eIF2a的PKR磷酸化来下调翻译，这削弱了eIF2的活性，抑制了mRNA的翻译，从而抑制了对蛋白质合成。消除这种先天免疫应答的主要方法是在序列中使用例如1-methylpseudouridine和其他存在tRNA和rRNA中的不常见的核苷酸而不是常见的核苷酸，是的固有免疫系统对他们不敏感。这种修饰技术已经在在BioNTech / Pfizer和Moderna SARS-CoV-2**中使用，并且在临床试验中显示出> 94％的有效效。另一种方式是CureVac所采用的：通过密码子优化和尽量不使用鸟苷酸，因为TLR7和TLR8主要识别富含GU的单链RNA序列。

       mRNA治疗的第二个挑战是其对核酸酶的敏感性，例如血清中半衰期小于5分钟。尽管siRNA的化学修饰在提高稳定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今为止，由于翻译机制对这些修饰的敏感性 ，它们尚未成功用于mRNA修饰。

       mRNA的第三个挑战是除未成熟的树突状细胞外，大多数细胞类型中缺乏裸露的mRNA的细胞摄取能力。通过合适的递送系统携带mRNA可以解决这最后两个挑战，既可以保护mRNA不受酶的攻击，又可以促进细胞的摄取。比如，在动物模型中使用脂质纳米颗粒载体系统与nakedmRNA相比，mRNA的表达效率可以提高1000倍。

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       递送系统

       这些临床试验中的所有mRNA递送系统都是脂质纳米颗粒，辉瑞-BioNTech LNP和Moderna LNP的确切组成已公开披露，而其他一些则没有，其他的都最有可能类似于Alnylam Onpattro™产品。

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       脂质纳米颗粒的组装和结构

       目前，mRNA脂质纳米颗粒的生产方法利用微流体或T型接头混合，将含有疏水性脂质的乙醇相和含有mRNA的水相快速混合在pH值为4的缓冲液（如乙酸）中。微流体混合的优势在于能够将乙醇中的极少量脂质与水溶液中的mRNA（数十微升）混合，从而可以筛选许多组分和配方参数。

       另一方面，T-mixing是商业生产大批mRNA LNP（例如当前临床试验中的LNP）的通用选择方法。最近的文献证明这两种方法均可以生产大小和形态相似的LNP颗粒，将最终生产的颗粒尺寸限制为<100 nm，其中两种溶液的快速混合是关键。由这些溶液组装和形成LNP的过程是由疏水力和静电力共同驱动的。四种脂质（可电离脂质，DSPC，胆固醇，PEG-脂质）最初可溶于乙醇，而没有其他可中和的离子，因此可电离的脂质为非质子化且电中性。通常将一体积的含脂质的乙醇溶液与三体积的mRNA在pH = 4的醋酸盐缓冲液中混合，这样，当脂质与含水缓冲液接触时，它们变得不溶于3：1的水/乙醇溶剂和可电离的脂质变成质子化并带正电荷，然后驱使它与mRNA的带负电荷的磷酸骨架静电结合，形成包裹mRNA的脂质颗粒并在水溶液中悬浮液中。

       该过程中的关键成分是PEG-脂质，因为PEG链是亲水性的，因此可以包覆颗粒，并决定其最终的热力学稳定尺寸。通过改变PEG的摩尔分数，可控制LNP的大小，例如100 nm颗粒时PEG-脂质为0.5％摩尔分数，43 nm 颗粒粒径事PEG-脂质为3％摩尔分数。

       最近一项重要数据显示，当将mRNA LNP悬浮液在水性缓冲液中稀释或在水性缓冲液中透析以提高pH值并消除乙醇时，LNP的结构和大小在混合后仍在继续变化。水相和脂质相的初始混合产生的pH值接近5.5，使可电离脂质质子化，其LNP pKa值接近6.5，并促使mRNA结合和封装。随后通过稀释、透析或切向流过滤提高pH值，可中和可电离的脂质，当可电离脂质变为中性时，它的溶解度也降低，导致形成较大的疏水性脂质结构域，从而驱动LNP的融合过程，从而增大其尺寸，LNP的核心变成非晶态的电子致密相，主要是含有与mRNA结合的可电离脂质。据估计，在此过程中，多达36个囊泡可融合形成仅一个最终的LNP。这项研究以及另一项使用中子散射方法的研究也表明，DSPC在LNP外围PEG层的下方形成一个双层，其中心核心主要是与mRNA结合的可电离脂质。

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       递送系统性能的决定因素

       mRNA传递系统的性能决定因素是多因素的且相互作用的，包括：（1）它们传递至合适细胞并有效释放mRNA到细胞质进行翻译的效率；（2）佐剂，可增强免疫反应，已知脂质纳米颗粒具有其自身的佐剂活性；（3）将注射部位过度炎症或全身分布和脱靶表达可能引起的不良事件或**的影响降至最低。4）剂量：在SARS-CoV-2临床试验中，目前正在追求的大剂量剂量最容易理解mRNA递送系统的效力，从1到100 μg。人体试验中的剂量明显分为高剂量的核苷修饰RNA（Moderna，BioNTech）30–100 μg，未修饰的RNA（CureVac，Translate Bio）较低的7.5–20 μg，甚至低剂量的10–10 μg；5）LNP最常引用的决定其效价或递送效率的特征是其pKa。pKa是LNP中50％的可电离脂质质子化的pH。一个很好的解释这种pKa依赖性的模型是基于LNP中的可电离脂质在pH 7.4时接近中性，而在内化进入细胞后，内体的pH值随着通过内溶酶体途径的发展而开始下降。使可离子化的脂质质子化，然后将其与内体的阴离子内源性磷脂结合并破坏其双层结构，从而将mRNA释放到细胞质中通过核糖体进行翻译。

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       结论

       在过去的二十年中，mRNA治疗技术取得了非凡的进展，首先是确定了使用修饰的核苷和序列工程技术来控制mRNA固有免疫原性的方法，以及在**和其他治疗适应症中应用mRNA的方法。与以前的系统相比，采用siRNA传递中使用的脂质纳米颗粒原型导致传递效率提高了一个数量级，并且仍在不断提高，这主要归功于新型可电离脂质的设计。mRNA LNP结构、功能、效价、靶向性和生物学特征（如佐剂性）的许多方面仍有待探索，以便充分利用这种强大的转化治疗方式的潜力。

       参考文献：

       https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7836001/， Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines.