对于生物制品，如**、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及酶等，多以溶液形式生产，这些昂贵的产品在常温条件下极易发生蛋白质的快速降解导致活性降低。这些产品通常被冷藏储存和运输，对冷链的依赖使这些产品更加昂贵。

       目前延长生物制品保存期限的方法主要有以下几种，（1）快速分析核酸技术（FTA）：FTA卡片是经化学试剂特殊处理的棉纤维卡片，通过干式化学稳定基质保存生物样本中的核酸。但FTA卡片只能用于常温下保存样品中的核酸，且DNA和RNA只能保存一种，卡片亦不适用于保存及分析生物材料中其他成分比如酶和其他蛋白。（2）福尔马林固定石蜡包埋技术：该技术可将组织在常温条件下保存较长时间，但处理过程中固定液的交联作用使得DNA受损伤，出现片段化，并且固定和包埋的操作也会导致RNA和蛋白质的质量下降。（3）真空冷冻干燥技术：该技术是将含有水的生物样品预先冷冻成固态，再在低温低压条件下进行水的升华作用，最后生物样品低温脱水而达到干燥的技术，然而整个冻干过程中生物样品需承受各种各样的应力，这些应力常常直接或间接导致蛋白不稳定。为了克服以上这些技术的缺点，玻璃化冷冻技术应运而生，并且在生物样本的常温稳定保存方面表现出极大的优势。

       1.玻璃化冷冻技术的特点

       玻璃化冷冻技术是将物质转变成玻璃样无定形体的技术。玻璃化是液态物质在一定的降温速率下由液相直接传变为玻璃化的固体状态的过程，期间没有晶体结构的生成，也能够保持液相时期的分子以及离子的分布，在冷冻和解冻的过程里也不会在液态和晶体之间来回的变化，这时所表现出的力学性质与玻璃相似，故称这种状态为玻璃态，是一种介于液态与固态之间的状态。

       液体在冷冻过程中以何种状态固化，取决于液体黏滞系数、降温速率及液体总体积。从理论上讲，只要获得足够的降温速度，任何液体都可以进入玻璃态。实现玻璃化需要足够快的冷却速度，当温度下降，势垒足够大，此时分子构象被冻结，与环境之间由扩散控制的物质交换及化学反应在动力学上受阻，而蛋白质大多数降解途径是由于分子的运动性，因此玻璃化体系具有良好的结构和化学稳定性。发生玻璃化转变时所对应的温度称之为玻璃化转变温度（Tg）。保持制品的玻璃态需储存在低于或等于该物质的Tg，若制品的Tg高于室温，则有希望实现室温下较长时间的稳定保存。玻璃化冷冻技术只需达到较高的降温速度即可，无特定仪器的需求，比如可直接投入液氮，节约了成本，玻璃化冷冻技术还有操作步骤简便、储存稳定性好、复苏率高等优势。此外，在低**的保护剂浓度和较高降温速度的前提下优化玻璃化制品的Tg，可实现制品的常温储存，这对于玻璃化冷冻技术的进一步发展和应用具有重要意义。

       2.玻璃化冷冻技术影响因素

       2.1冷冻保护剂（CPA）

       玻璃化过程中包含快速降温步骤，一般需添加CPA。对一般制品来说，其能够保持玻璃化过程中制品结构的稳定，对细胞来说，其能够防止胞内水结晶，避免应力损伤细胞膜。主要分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。

       渗透性冷冻保护剂主要包括乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜、丙三醇等，它们水溶性较强，可以较为快速的进入细胞内，抑制细胞内冰晶的产生，但对细胞有不同程度的**作用。非渗透性保护剂主要为蔗糖、葡聚糖、海藻糖、聚乙烯毗咯烷酮、抗坏血酸等，不能渗透入细胞膜内，只能起到提高细胞外渗透压的作用。

       2.2降温速率

       玻璃化过程中的降温速率是影响玻璃化效果的重要因素。玻璃化制品中液体在熔点（Tm）以下的温度时为过冷态，当降温速度较慢以至于系统可以保持在准热平衡态，那么玻璃化制品就可能在Tm处发生晶化以致不能达到玻璃态。

       2.3其他因素

       制品的体积及冷冻载体也影响玻璃化制品的降温速率。越小的冷冻容量，获得的冷冻效果越好，开放性载体如开放式麦管、EP管等，制品与液氮直接接触，能够实现更高的降温速率，但有易污染、保存数量少、成本高等缺点。封闭式载体如拉细麦管、冷冻钩等，可避免污染，但延长了体系在冷冻液中的时间，对操作要求很高。样品本身含水量也会对玻璃化过程产生影响。一般制品水分含量每增加1%，其玻璃化转变温度会下降5～10℃。

       3.玻璃化冷冻技术的应用

       3.1蛋白类药物

       基于蛋白质的生物药物，如多肽、单克隆抗体和基因工程抗体、重组**，多严格按照冷链储存。玻璃化冷冻技术可作为理化性质不稳定的蛋白质药物制剂的有效制备方法，延长药品的贮存时间，尤其对于热敏性蛋白药物，如昂贵的新型**肺炎球菌结合物，轮状病毒和HPV**等，能够实现非冷链条件下稳定储存的目的。研究通过用海藻糖和明胶等生产了减毒活沙门氏菌Ty21a细菌**玻璃体制剂，在37℃时能够稳定贮存约3月。

       3.2生物酶

       市面上商品化的生物酶一般与甘油按一定比例混合后在低温条件下保存，而玻璃化冷冻技术在生物酶的应用上，亦改善了生物酶制品的存放环境条件。采Ficoll400和松三糖制得了玻璃化的限制性内切酶能够在室温或者37℃条件下稳定存放4个月，玻璃化酶制品的应用还可避免储存或运输过程中冷链断裂带来的假阴性结果，并且延长其活性稳定的贮存时间。

       3.3细胞与胚胎、组织

       玻璃化冷冻技术在细胞与胚胎、组织中已应用良多，采用玻璃化冷冻技术的优势主要体现在显著改善其复苏率方面，并且开发出新的细胞、胚胎、组织和器官等的保存方法。在冷冻保护液中对人类受精卵进行玻璃化，20个受精卵在玻璃化过程中皆存活，18个受精卵在培养24h后恢复分裂。

       3.4食品

       食品在低于Tg时贮藏能最 大限度的保存食品质量。在玻璃态下，由于分子运动的限制，造成食品品质变化的一切受扩散控制的反应均变得十分缓慢，甚至不会发生。此时食品的各方面性质都很稳定，对食品的贮藏和鲜度等品质的维持非常有利。对带鱼制品进行玻璃化发现，添加保护液的带鱼制品各指标的下降速度均低于空白对照组，玻璃化鱼肉可以抑制蛋白质冷冻变性、保持蛋白质原有结构和功能，比普通贮藏的保鲜期延长了约20d。

       玻璃化冷冻技术的主要目的在于实现更长时间，更简便条件的储存，其凭借显著的优势已经广泛应用到诸多领域。玻璃化冷冻技术的未来发展空间在于Tg的提高，高的Tg不仅能够提高贮存稳定性，还可以实现产品的常温条件下的储存。影响玻璃化冷冻技术效果以及Tg的因素，主要是CPA的组成、进行玻璃化时的降温速率、玻璃化载体的选择，并且开发新的玻璃化载体也是未来研究的方向。对于生物药物，虽说玻璃化态在非冷链下存放已实现，甚至能保持数月，但还需要大规模重复安全性和免疫原性研究以获得玻璃化改进的批准，所以现有生物药物到玻璃化状态的发展还需时日。

       参考文献：

       [1]邢思熙,梁硕,徐晓筱,邹秉杰,宋沁馨,周国华.玻璃化技术及其应用研究进展[J].药物生物技术,2021,28(03):284-290.DOI:10.19526/j.cnki.1005-8915.20210313.

       [2]徐利,葛凤菊,黄亚.玻璃化冷冻技术的应用及研究进展[J].现代妇产科进展,2018,27(01):75-78.DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2018.01.019.

       作者简介：沙罗，中药研发工作者，现就职于国内某大型药物研发公司，致力于中药新药的研究开发。