历时三年甚嚣尘上的“亚硝胺事件”如今有了新的进展。

       FDA从最初的单纯亚硝胺杂质的检测，到开始关注携带亚硝胺结构的目标产品杂质。

       例如治疗帕金森病的药物雷沙吉兰（Rasagiline，商业名称：Azilect?）中发现的亚硝胺类杂质，N-亚硝基雷沙吉兰；以及在治疗动脉硬化、自发的和脑炎性的帕金森病的药物奥芬那君（Orphenadrine）中发现的N-亚硝基奥芬那君（叔胺也能引发亚硝胺形成的完 美案例, 图1）。

       后者引发了Sandoz 今年5月份的13个批次的药品召回。相对于NDMA和NDEA这样的单纯亚硝胺杂质，这些产品相关的亚硝胺杂质的上限值非常低。

       图1. 雷沙吉兰和奥芬那君以及它们的N-亚硝基杂质

       EMA近日发布了针对特定药品的亚硝酸杂质限制指南，其中囊括了许多易感药物。该指南对这些易感药物的亚硝胺杂质上限提出了建议。

       指南规定，如果某种药物已形成亚硝胺类杂质，但具体限值没有在此份指南中限定的话，将统一采取18 ng/天的ADI (Acceptable Daily Intake, 每日允许摄入量) 标准。

       FDA目前使用的标准相对宽松，为26.5 ng/天，但ANVISA (巴西国家卫生监督局), Health Canada (加拿大卫生部)， TGA (澳大利亚药品管理局) 等监管机构都遵循EMA的18 ng/天的限值标准。

       1

       亚硝胺的遗传毒 性和致癌性

       亚硝胺类化合物属于“关注类”高诱变致癌物，该类物质已被世卫组织国际癌症研究机构IARC归入可能是人类致癌物类别。

       大多数亚硝胺被认为具有诱变性和致癌性，至少在动物中是这样，并且最强和最弱的亚硝胺之间的效力差异很大。IARC （国际癌症研究机构）已将具有可用动物数据的那些分类为 2A 或 2B 类。目前，尚缺乏足够的物质特异性人体数据，但只有一些与烟草相关的亚硝胺被归类为 1 类（例如 NNN、NNK）。那些来自动物数据的亚硝胺因人体数据不足被归类为第 3 类。

       亚硝胺致突变性和致癌性的原理也被认为与人类相关。在致突变和致癌性方面最受关注的是一些可能在食品中形成的挥发性亚硝胺，例如：二甲胺亚硝胺 NDMA、二乙胺 亚硝胺 NDEA、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基哌啶等。

       如同亚硝酸盐一样，亚硝胺本身并不直接导致诱变性和致癌性。

       如图2所示，摄入体内的亚硝胺类物质1，在细胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化为α-羟基亚硝胺2 。后者通常不稳定，消除一个醛分子并转化为1-羟基-2-烷基二亚胺3。化合物3经过脱水产生烷基叠氮盐（diazonium）4，这个不稳定的叠氮盐在释放一分子氮气后转化为高活性的碳正离子5。

       在这个过程种形成的碳正离子，可以说是亚硝胺化合物遗传毒 性和致癌性的直接凶手，而亚硝胺（或者后退一步，亚硝酸盐），可被视为元凶。由于高度的亲电性（NDMA形成的碳正离子为甲基正离子，具有比其它烷基正离子更高的活性），碳正离子5 作为一个高效的烷基化试剂进攻蛋白质和DNA上的众多亲核基团，产生烷基化的结果，从而产生潜在致癌致突变型。

       图2. 亚硝胺生物体内转化为碳正离子，以及碳正离子修饰DNA的生化过程

       目前，FDA已经认定了六种可能存在与药品中的单纯亚硝胺物质，并规定了它们的ADI (每日允许摄入量)，如表1所示。

       表1. FDA认定的6种可能存在于药品中的单纯亚硝胺杂质

       2

       亚硝胺的可能来源

       1药物以外领域

       环境

       亚硝胺可以在环境中产生。它们在空气中主要通过燃烧过程形成，而在水中则通过微量的生物过程形成。

       食物

       在食品中，亚硝胺的形成主要是通过肉、鱼和其他产品中的亚硝酸盐和亚硝胺在较高温度下发生反应而形成的。上世纪七十年代至九十年代，这种形成和发生引起了人们的极大关注，并已采取措施减少食品生产中硝酸盐和亚硝酸盐的使用，以期最大限度地减少亚硝胺类物质的产生。

       欧洲食品安全局 (EFSA) 对此进行了审查，该机构参考了各种调查，得出的结论是，加工肉类所产生的挥发性亚硝胺物质 (如NDMA 二甲基亚硝胺，以及 NDEA 二乙基亚硝胺)，其每日最高摄入量为0.2 ng/公斤/天（婴儿） 至3.5 ng/公斤/天（幼儿）。

       饮用水

       在德国，饮用水中 NDMA 的控制限值为 10 ng/l。加利福尼亚州的公共卫生目标是饮用水中亚硝胺的浓度上限为 3 ng/l。

       技术加工产品（例如农药、橡胶、啤酒、化妆品）

       农药、橡胶、啤酒、化妆品这些加工产品可能存有亚硝胺。用弹性体制成的玩具中的亚硝胺≤10 μg/kg，亚硝酸盐≤100 μg/kg。在化妆品中，亚硝胺的含量不应超过 50 μg/kg。

       兽药产品 (VMP)

       兽药产品中 DNA 反应性（诱变）杂质是指具有极高致癌效力的诱变剂（不仅包括亚硝胺，还包括其它诱变剂的“关注类群Cohort of Concern, CoC“）。诸如类黄曲霉毒素和烷基-偶氮基结构。即使低于 TTC（Threshold of Toxicological Concern, 毒理学关注阈值） 的摄入量，在理论上存在显著的致癌风险。应根据其具体情况确定其可接受摄入量。原则上，这些具有极高的致癌效力物质不应作为 API 或 VMP 的杂质出现。

       2药物中亚硝胺杂质的产生

       2018年7月，在某批次的Sartan类药物中检测除了超出ICH M7(R1) AI (Acceptable Intake) 规定限值的NDMA, NDEA, DIPNA 和NMBA亚硝胺杂质。同年9月，所有欧盟授权的血管紧张素II受体拮抗剂/阻滞剂，都要求对其生产工艺以及产生亚硝胺杂质的风险做出彻底评估。这些药物的共同特点在于，它们都含有四唑结构单元，涉及坎地沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦和缬沙坦等一系列沙坦类药物（图3）。这些药物API合成过程中的四唑环生成反应，都可能引发亚硝胺杂质的产生。

       图3. 四唑及沙坦类药物化学结构

       此后，一家吡格列酮（Pio g litazone）的制造商通知欧盟当局和欧洲药品质量局，报告了在它们的药物中发现了NDMA杂质的情况。尽管其含量低于ICH M7(R1)规定的临时限值，但亚硝胺在非沙坦类药物中的出现引发了关注。

       2019年7月，欧洲药品质量局通报了另一家制造商生产的缬沙坦中发现NMPA（N-亚硝基-N-甲基苯胺）的情况。2019年9月，一个批次的雷尼替丁的原料药和成品药中均检测出了NDMA （图4）。

       图4. 吡格列酮与雷尼替丁化学结构

       从2019年5月开始，欧洲范围内的”Lessons Learnt Excercise”活动广泛开展，以期从沙坦以及其它药物中产生亚硝胺杂质的案例中汲取教训，并于2020年6月24日发布了最终报告。

       3

       药物中亚硝胺的来源

       1水

       如果合成原料中便含有亚硝胺杂质，它可能被携带到最终的成品。同样，如果原料中还有亚硝酸盐，它可以与试剂，原料，中间品，产物，溶剂中广泛存在的氨基发生反应，产生亚硝胺。水处理的过程中可能产生二甲基亚硝胺（NDMA）。

       例如自来水通过氯胺化或者氯化的消毒的过程可以生成NDMA (氯胺与二甲胺之间的反应产生NDMA)。在阴离子交换处理水的过程中，NDMA也有可能生成。自来水中的微量亚硝胺通常经过紫外线辐射的方法被去除。

       世卫组织目前规定的饮用水中NDMA的限值为0.1 微克/升 （0.1 ppb）。尽管NDMA在水中有很高的溶解度（290 g/L），但考虑到水中极低的NDMA浓度，水成为药物亚硝胺杂质形成主因的可能性很低。

       虽然水本身携带亚硝胺的可能性不大，但经消毒处理过的水，却有可能与药物反应产生亚硝胺，这一点在两份研究中被证实。第一项研究使用了氯胺化的水处理了20种药物, 第二项研究使用的是臭氧消毒的水处理雷尼替丁。NDMA在这两项研究中均被发现。

       2溶剂、试剂、催化剂

       亚硝酸盐也是产生亚硝胺的罪魁祸首之一。亚硝酸盐常用于有机合成，比如叠氮化钠的淬灭剂，这也是沙坦类药物产生亚硝胺的主因。

       常用的有机溶剂，比如二甲基甲酰胺（DMF），N-甲基吡咯烷酮 (NMP)和三乙胺 (TEA)，都可能含有不同种类的胺类杂质，比如二甲胺 (来自于DMF)，4-甲氨基丁酸（来自于NMP）和二乙胺(来自于TEA)。这些仲胺杂质有可能与亚硝酸盐反应，生成亚硝胺。

       相转移催化剂三乙胺盐酸盐（TEA.HCl）和四丁基溴化铵（TBAB）可作为前体形成NDEA（二乙基亚硝胺）和DNBA (二丁基亚硝胺)。

       3原料药生产工艺导致的

       在沙坦类药物的合成中，四唑的环化是由有机腈与叠氮化钠的环加成反应在高沸点溶剂（如二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮）中实现的，反应结束后，过量的叠氮化钠用亚硝酸钠淬灭。然而在这个过程中使用的二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中分别含有二甲胺和4-甲氨基丁酸杂质（这些杂质即可能是这些溶剂的合成原料，也可能是溶剂分子降解的产物）。这些仲胺在叠氮化钠的淬灭反应中与淬灭剂亚硝酸钠作用，产生了相应的亚硝胺NDMA (二甲基亚硝胺) 和NMBA (N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸)。

       这个过程是沙坦类药物产生亚硝胺杂质的根本原因（图5）。尤其是考虑到叠氮化钠淬灭是整个沙坦合成工艺的最后一步，产生的亚硝胺杂质污染最终产品的可能性大大增加。

       吡格列酮案例中二甲基亚硝胺（NDMA）形成的机理类似于沙坦，不同的是， 亚硝酸钠与而二甲基甲酰胺并不出现在同一步反应中，而是上一步的亚硝酸钠被部分携带到二甲基甲酰胺的步骤，从而形成了亚硝胺杂质。

       图5. 四唑环化，叠氮化钠淬灭，以及DMF/NMP介导的亚硝胺形成反应。

       1977年，德国德国联邦卫生局紧急召回了氨基比林（aminophenazone）, 原因是在此药物中发现了340ppb的二甲基亚硝胺。调查给出了此杂质产生的原因是：氨基比林中的二甲氨基水解释放二甲胺，与药物中的痕量亚硝酸盐杂质反应，形成二甲基亚硝胺杂质（图6）。这是一个由于药物自身降解导致亚硝胺形成的案例，也为人们提出了这样的警示：药品产物中，不仅要检查亚硝胺杂质，也要建立亚硝酸盐的质量标准。

       图6. 氨基比林降解导致二甲基亚硝胺形成的机理

       图7. 发现亚硝胺杂质的药物

       图7总结了文献报道过的检测出二甲基亚硝胺的药物结构。可以发现它们都含有二甲氨基的化学结构。

       4制剂过程中形成的

       很多赋形剂中含有ppm含量硝酸盐或者亚硝酸盐，比如羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、预糊化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、交联聚乙烯吡咯烷酮 (cPVP) 和乳糖。2019年9月，一份新的二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺产生机理报告被递交到了监管部门。该报告提出，NDMA/NDEA 似乎是在盖箔印刷过程中形成的，N-亚硝胺的形成是由盖箔中的硝化纤维素与含胺印刷油墨 [二甲胺 (DMA) 和二乙胺 (DEA)] 反应引起的，并通过汽化和冷凝热封起泡过程转移到在成品上。由于增塑硝化纤维碎片的爆燃温度，在热诱导分解时会产生不同的氮氧化物。从硝酸纤维素中释放出氮氧化物以及随后在印刷药物油墨中对胺进行亚硝化被认为是合理的。

       4

       总结

       在沙坦类药物召回的事件后，亚硝胺杂质已经成为了FDA, EMA 等药监机构的心头大患，各制药企业也对其制药工艺进行彻查，以杜绝亚硝胺杂质产生并且污染药品的隐患。

       从目前的根源检查来看，包括亚硝酸盐在内的亚硝酸化物质，在生产过程中与仲胺，叔胺，甚至季胺盐的接触，是产生亚硝胺的最大根源。除此之外，沙坦事件的一大警示在于，常见有机溶剂，例如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮，三乙胺等，也被视为可与亚硝酸化试剂反应而产生亚硝胺的前体。制造商需要对原料药和成品药的生产工艺进行彻底专业的风险分析，以评估其产生亚硝胺杂质的可能性。这个过程不仅要包含生产工艺本身，也要扩展到所使用的原料，试剂，溶剂和包装材料。对于有可能形成亚硝胺的工艺，需要进行调整以规避亚硝胺的产生。当然，这一切都是要建立在一套有效的分析手段之上。