众所周知，传统的抗体-药物偶联物（ADCs）通常需要内化到癌细胞中以释放其细胞毒有效载荷。目前全球一共有14个ADC药物获批上市。当下，ADC药物已发展成为继小分子药物、单克隆抗体后的新一代靶向抗癌药物。

       然而，这类ADC药物往往需要肿瘤靶点具有高表达的内化抗原和高效的细胞内裂解活化效率，这对于肿瘤靶向治疗的发展带来了诸多限制。因此，研究人员开发了一种新型的研发策略-非内化ADC设计策略。通过这种方法，有效载荷可以在与内化不良的抗原或其他肿瘤成分结合时从可裂解的连接物中释放出来。这不仅消除了对高抗原表达的依赖，避免了潜在的低效内化，还可以极大地扩展肿瘤靶点的范围，包括：细胞外肿瘤基质相关靶点。

       本文介绍了近年来非内化ADCs的最新研究进展。此外，还介绍了肿瘤相关的细胞表面和细胞外蛋白、肿瘤间质靶向性和使细胞外有效载荷释放的连接化学。

       ADCs介绍

       1  背景介绍

       抗体-药物偶联物（ADCs）是一类肿瘤治疗药物，通过与高度特异性的单克隆抗体结合提供靶向药物传递（图1）。这种药物结合了抗体的靶向能力和小分子药物的细胞毒 性。与ADCs的典型作用机制不同，本文侧重于介绍不需要内在疗效的ADCs。

       图1. 一种ADC的结构及可替代抗体的模板

       2  非内化ADC的作用机制

       ADC通常被设计为通过内部化的机制发挥作用：抗体与癌细胞上的靶抗原结合后，ADC通过内吞作用内化，然后在溶酶体中降解，释放细胞毒有效载荷（图2A)。如果有效载荷具有适当的膜透性，它可以扩散出释放它的细胞，进入周围的“旁观者”癌细胞，这些癌细胞可能表达或可能不表达目标抗原（称为旁观者效应）。虽然这种方法是成功的，（事实上，目前FDA批准的所有ADC都使用内化抗体），但它确实存在一定的局限性，如依赖内化抗原的过度表达不是许多肿瘤的特征。此外，抗体是大分子蛋白质，因此由于扩散缓慢，对肿瘤的渗透也比较有限。

       先前的理论认为内化对ADC的治疗至关重要，但越来越多的研究表明替代作用机制可能会更加有效。不需要溶酶体降解来释放细胞内的有效载荷，抗体-药物连接可以设计成在细胞外肿瘤环境中不稳定（图2B)。这利用了癌症与健康组织相比的独特的化学或酶环境。细胞外释放的有效载荷可以扩散到周围的癌细胞中，发挥其细胞毒 性作用。非内化作用机制可能会扩大肿瘤靶点的范围，因为它排除了内化ADCs的严格要求，如高内化抗原表达。事实上，一些非内化的ADCs可以针对大多数侵袭性癌症常见的生理肿瘤特征，因此可能是一种有希望的广谱抗癌方法。有效载荷在细胞外的释放也可使抗癌剂更深地渗透到肿瘤中，这是由于抗癌剂与抗体相比易于扩散，并可使潜在的旁观者效应最大化。

       图2. (A)内化ADC的机制 (B)非内化ADC的机制

       靶抗原的多种特征在决定ADCs的成功中很重要。例如，目标靶抗原在靶癌细胞上高表达，但不在健康细胞上高表达，以确保治疗的特异性和避免脱靶毒 性。抗体-抗原结合相互作用的性质决定了构建体是否发生内化（以及多快）。为了成功地内化ADCs，抗体必须快速诱导受体内化、内体转运和溶酶体加工（图2A)

       相反，对于非内化的ADCs，由于内化不需要在抗体结合后以相当大的速度发生，这些需要在细胞内完成的步骤可以忽略。随着人们对非内化ADC的探索，与此同时越来越多的抗体-抗原相互作用内化不良的病例也被不断地发现。

       3  非内化ADCs对抗B细胞抗原的机制

       作为对多种ADCs作用机制研究的一部分，Polson等人检查了非内化ADCs对抗B细胞CD20、CD21和CD72抗原的可行性。

       在这项工作中，他们用含有二硫化物或Val-Cit二肽的不可裂解或可裂解连接体生成了多种ADCs。他们发现，可裂解的二硫化物ADCs即使对体内内化非常差的抗原靶点CD20、CD21和CD72也很有效。假设二硫键可以在细胞外裂解，从而发挥非内化机制的作用。同样在这项工作中，含有Val-Cit连接体的Anticd21 ADC的MMAE有效载荷被MMAF取代，MMAF是一种含有带电羧酸末端的类似物（图3C)，它阻碍了它在细胞膜上的扩散能力。这一变化消除了ADC的活性，表明释放的有效载荷在细胞膜上的扩散对活性至关重要，从而支持了所提出的细胞外作用机制。显然，这一数据与二硫化物和Val-Cit可裂解连接体需要内化才能释放有效载荷的经典观点相矛盾，并证明了在细胞外的连接体裂解是可能的。

       图3.(图A)Polson等人研究抗多种B细胞抗原的ADCs文库(图B)与抗体结合的连接体结构（C）常见的细胞毒素药物

       非内化ADC的靶向部位及作用

       1  靶向膜蛋白

       PD-L1:

       程序性细胞死亡配体1(PD-L1)是一种跨膜蛋白，它与T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白-1结合，抑制T细胞功能，使癌细胞逃避免疫系统。PD-L1在各种类型的实体癌中表达上调，并常与预后不良和生存率降低有关。目前已有三种抗PD-L1的抗体获得FDA批准：Avelumab（默克）、Atezolizumab（罗氏）和Durvalumab（阿斯利康）。由于PD-L1的瞬时和异质性表达以及大量抗体在致密的肿瘤间质中的穿透性差，使得这些抗体在治疗肿瘤受到了比较大的限制。因此，非内化的ADC方法是具有吸引力的，因为细胞外有效载荷释放可以克服这些问题。虽然在以前的研究中观察到可裂解的Val-Cit连接子在细胞外裂解，但在本研究中需要内化，可能是因为细胞外连接子裂解的水平不确定。在细胞系、肿瘤类型之间，甚至在临床前小鼠模型和人类之间，细胞外蛋白酶或其他连接物触发物的水平是不同的。因此，体外和体内应用细胞外可裂解连接物可能需要逐案验证可用内源性触发物的水平。

       CEACAM5：

       癌胚抗原细胞黏附分子5(CEACAM5)是许多类型癌症的生物标志物，通常不会明显内化。靶向该抗原在临床前肿瘤模型中成功得到验证，利用pH敏感的碳酸酯或酯连接物在细胞外酸性肿瘤微环境中从ADCs释放SN-38。

       Goldenberg等人研究了抗CEACAM5拉贝妥珠单抗ADCs在人结肠癌、人胰 腺肿瘤和全身性淋巴瘤异种移植瘤小鼠模型中的活性。所有ADCs都含有不耐酸的碳酸盐或酯部分的连接物，一些底物具有额外的蛋白酶可分离的苯丙氨酸-赖氨酸（Phe-Lys）残基（图5）。幸运的是，尽管CEACAM5的内化性很差，但24个ADCs在CEACAM5阳性的淋巴瘤肿瘤靶模式中诱导了100%的存活率，其中具有双重可裂解接头CL2（图5）的ADCs在体内的表现最好。作者提出了一种非内化的作用机制，即SN-38从ADC细胞外缓慢释放，允许游离药物的高局部积累。相对较高的碳酸盐/酯键活性被认为适合与SN-38一起使用，因为与金葡素或美坦辛类有效载荷相比，SN-38具有中等的细胞毒 性，允许药物轻松释放，而没有明显的脱靶毒 性。事实上，FDA批准的ADC Trodelvys含有通过CL2A连接体结合的SN-38（图5C)。尽管它的目标是高度内化抗原troP-2，但用高度稳定的连接取代CL2A连接体显著减少了E-cacy，表明从CL2A连接体中逐渐释放SN-38有助于E-cacy。

       图4. 抗CEACAM5非内化ADCs的结构

       图5. FDA批准的ADCs的结构包括其抗原靶点、肿瘤适应症、连接子结构、有效载荷和切割机制。

       NKA ：

       NKA是对所有细胞的功能至关重要的质膜离子泵：因此，NKA的抑制会导致细胞死亡。与经典的ADC方法不同，作者没有开发针对NKA的抗体（对健康细胞没有特异性），而是利用了其他癌症相关蛋白与NKA的接近性。Dydapherin是一种细胞膜糖蛋白，在许多转移癌中过度表达，并与NKA相互作用。将NKA的强心苷抑制剂与抗Dydapherin抗体结合，使抗体抗原与Dydapherin结合，使抑制剂与NKA非常接近。与NKA结合的抑制剂通过诱导细胞肿胀和随后的膜破裂导致细胞死亡（图6）。有趣的是，这种策略因为排除了连接子裂解，抑制剂在附着于抗体的同时也作用于细胞外。

       图6.NKA抑制非内化性ADC的作用机制

       2  靶向肿瘤微环境

       在不利用膜抗原的情况下靶向肿瘤的替代策略现已出现。依赖靶向膜抗原有几个缺点：因为很少有癌症均匀地过度表达抗原，而耐药性可以通过抗原表达的变化获得。取而代之的是，其他方法通过靶向细胞外肿瘤微环境的成分，如分泌的或细胞外蛋白，或靶向肿瘤基质丰富的结缔组织和血管，间接地寻求根除恶性细胞。

       3  靶向细胞外基质蛋白

       Galectin-3-binding protein(Gal-3-BP)，广泛存在于大多数肿瘤中，是肿瘤微环境靶向ADCs的一个有吸引力的靶点。亚科贝利等人研制了一种针对Gal-3-bp凝集素结合域的人源化抗体，通过直接与C-末端半胱氨酸和含硫的美坦辛类药物(DM1、DM3或DM4)形成混合二硫化物，以“无连接”的方式实现药物的结合。Neri实验室首次描述了这种无链接技术，他证明细胞外空间中高浓度的还原剂有助于选择性地裂解二硫化物，从而使细胞外药物释放。

       人们认为，在有效载荷释放和细胞死亡后，肿瘤微环境中释放越来越多的还原剂，在“连锁反应”中导致有效载荷释放和细胞死亡（图7A和B）。因此，含抗Gal-3-BP二硫化物的ADCs在体内实现了显著的肿瘤生长抑制，DM3结合物在最 佳剂量的小鼠异种移植模型中实现了长期和完全的缓解。

       图7.非内化抗Gal-3-BP ADC的结构和机制

       4  靶向机制或肿瘤血管

       许多实性肿瘤表现出致密的细胞间基质：结缔组织和血管网络，阻碍了大分子深入肿瘤（图8）。这往往是ADC成功治疗实体瘤的障碍。一个新的策略替代靶向位于基质屏障后面的肿瘤细胞，是靶向基质本身。ADC在基质中的积累可以使肿瘤微环境中的细胞外有效载荷释放，然后扩散到邻近的肿瘤细胞中。由于小分子的扩散大于单克隆抗体，使得活性药物对实体瘤的渗透性有望得到改善。

       这被称为“癌症基质靶向治疗”(CAST)。此外，经典ADCs对几种实体肿瘤（结直肠、肺、胰 腺）的治疗由于其异质性靶抗原表达而受到例了限制。因此，一种替代的靶向方法是修饰的肿瘤细胞外基质的成分包括胶原、纤维连接蛋白、和纤维蛋白，由于它们在肿瘤基质或血管中的丰富度、稳定性和选择性，使得他们可以成为具有非常具有吸引力的靶标。

       图8.（图A）经典内化ADCS治疗有致密细胞外基质的实性肿瘤。（图B）肿瘤基质靶向治疗(CAST)的方法。

       外源性触发细胞外释放

       虽然大多数ADC依赖于内源性触发物释放有效载荷，如肿瘤相关酶或不同的肿瘤pH值，但已开发出一种新的替代方法，即从ADC中单独外源引入小分子触发物。在给药可裂解的、非内化的ADC后，允许ADC与靶抗原结合的时间，以及从血液中清除任何未结合的、未靶向的ADC以抵消离靶效应的时间。随后，给予外源性释放触发器，仅激活作用位点处的ADC（图9）。

       与传统的ADCs不同，这种方法不依赖于自然生物激活机制的切割，如有效载荷释放的某些酶的存在或特定浓度，这可能在癌症和患者之间存在很大差异。因此，生物正交活化可以允许更可预测的药物释放速率，空间和时间控制。

       图9.外源激活ADCs的作用机制。（这里显示的是以Diabody格式靶向细胞外蛋白的抗体。在ADC从血液中清除后，小分子外源性激活剂仅在作用部位被给予以引起连接体裂解和有效载荷释放）。

       肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)在多种实体肿瘤的癌细胞表面会发生过度表达。Rossin等人已经证明了它作为非内部化ADC靶向的适用性。WHO利用生物正交逆电子需求Diels Alder(IEDDA)反应生成非内化抗TAG-72 ADC。在ADC中加入反式环辛烯连接体，使外源给药的小分子四嗪探针能够轻松地“点击释放”化学。随后一个哒嗪消除反应被触发，允许烯丙基氨基甲酸酯从反式环辛烯中裂解，释放游离的含胺的细胞毒素（图10）。因此，产生非内化ADC，该ADC可在通过外源触发器切割连接子后在细胞外释放有效载荷。

       在引入外源性探针之前，需要清除血液中未结合的ADC，以避免脱靶激活和有效载荷释放而导致的全身毒 性。因此，作者使用Diabody格式的ADCs由于清除速度更快，肿瘤穿透更深。在保留高肿瘤定位的情况下，与MMAE的Diabody-结合物在2天后给予四嗪点击激活剂，给予细胞外激活和MMAE释放。在健康的非靶组织中，Diabody-结合物的低保留提供了高的肿瘤选择性。在体内，TAG-72非内化点击释放Diabody ADC与具有Val-Cit可裂解连接体的TAG-72 Diabody-ADC的类似物进行了比较。在体内观察到点击释放ADC改善了肿瘤生长抑制，EC50s分别为185和35 pm（在结直肠和卵巢癌异种移植中）。

       相反，val-cit ADC由于MMAE的胞外释放有限而对肿瘤生长抑制无效。说明点击释放策略耐受性良好，使用ADC、四嗪活化剂或其组合并没有产生毒 性。尽管这种方法需要临床上开发两种不同的成分（ADC和激活剂），但预计该方法可以使用相同的激活剂应用于广谱癌症靶点（如许多实体肿瘤中存在的基质成分）。

       总之，作者证明了IEDDA哒嗪消除的适用性，以允许时间控制和无痕迹的ADC连接子裂解，激活有效载荷释放仅在细胞外的位点分泌，而不依赖于内源性肿瘤生物学效应。

       图10.（图A）反环辛烯与四嗪类外源激活剂的点击反应致抗TAG72非内化ADC“点击释放”的结构和机制。（图B）连接体的结构(C)四嗪外源激活剂的结构

       总结

       在过去十年的ADC研究中，越来越多的注意力转向开发具有细胞外有效载荷释放机制的非内化ADC，目的是改善经典内化ADC相关的一些缺点。例如，它们对高、同质抗原表达的依赖，将许多其他癌症类型排除在靶点选择之外等问题。因此，非内化ADCs代表了一种新的希望，可以通过非内化ADCs来有效治疗更广泛的缺乏合适抗原表达的癌症。

       参考文献

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