在抗体和蛋白类药物研究开发中，防止蛋白聚集一直是研发人员面临的主要挑战之一，这些聚集物不仅会影响药物的质量和疗效，还可能在体内引发免疫原性反应，导致安全性问题。

       大量研究表明，包材和给药装置常用的硅油和制剂处方中常用的吐温降解产物，是抗体或蛋白溶液系统中潜在的不稳定因子，本文结合相关研究文献以及东曜药业众多项目的处方开发、包材筛选的实战经验，对硅油、吐温和蛋白间的关系进行简要论述。

       西林瓶或预充注射器中的胶塞通常需要使用适量硅油硅化处理，以提高其润滑性，减少胶塞因摩擦产生的微粒污染。而胶塞上的硅油可能在处理、使用甚至储存过程中发生脱落，与水形成硅油-水界面，暴露出其疏水表面，从而会吸附药物，吸附的蛋白部分去折叠暴露疏水基团，在硅油-水界面形成蛋白膜，诱导蛋白聚集，同时形成的硅-蛋白颗粒也会导致微粒增加，因此液体制剂长期储存过程中的蛋白聚集增加及微粒增加，其包材硅油脱落可能是导致此现象出现的原因之一。许多文献研究了在加速条件下抗体和硅油的相容性，并对粒子进行表征，发现高温、剪切力和胶塞的硅化处理方式等因素均会诱导蛋白在硅油滴上沉淀，产生硅-蛋白微粒。

       Jones等人研究发现在蛋白溶液中添加0.5%的硅油，置于45℃试验5h后，会对四种不同分子量和等电点的蛋白质产生明显诱导聚集，其中血清白蛋白(BSA)有更大的聚集倾向，推测是由于其在四个分子中疏水性最强[1] 。

       Amgen公司通过在IgG1抗体溶液中加入1.5%的硅油后进行研究[2]，发现该浓度硅油会在溶液中形成每毫升含量约2×109~2.3×109个平均直径约为5μm的硅油液滴，而抗体则会吸附在液滴上大致形成一层蛋白膜，研究人员也通过0.02μm针头滤膜过滤对吸附在硅油液滴上的抗体进行了量化，下方Table 1为未添加硅油制剂过滤前后蛋白浓度差，Table 2则为添加硅油后过滤前后蛋白浓度差，二者浓度差的差值（见标记处）为吸附在硅油液滴上的蛋白量，可见除添加蔗糖的制剂外，均有明显的蛋白吸附至硅油液滴上。

       该研究发现，相对于静置，添加硅油的制剂搅拌后更容易导致蛋白的聚集，且转速越高蛋白聚集越快(Figure 1)。其中，未搅拌及搅拌转速低于200 rpm的样品在相同条件下聚体未增加。推测是由于搅拌破坏了蛋白在硅油上的吸附界面以及水-空气界面，从而导致了蛋白的聚集。而振荡搅拌在运输及使用过程中常常会发生，因此制剂开发过程中需要关注成品在振荡搅拌过程中的稳定性变化情况。

       破坏蛋白溶液-硅油界面，不仅会诱导蛋白聚集，还会导致微粒的增加。MedImmune公司早期研究发现[3]，在试管中蛋白溶液的液面添加一层硅油，分别使用针头旋转搅拌(Rupture)、固定针头旋转不搅拌(No rupture)及无针头旋转(No Needle)，发现用针头搅拌的样品微粒大大增加 (Figure 2)，推测使用针头搅拌硅油层，使蛋白持续暴露在水-气界面，导致微粒明显增加。

       但是，此情况在加入聚山梨酯20/80后有所好转。研究人员在蛋白溶液中加入聚山梨酯20/80，对含有硅油层的蛋白溶液进行针头搅拌，相对于未添加聚山梨酯20/80的溶液，微粒明显降低 (Figure 3)， 该研究也表明，加入聚山梨酯后，蛋白聚集也有所抑制。

       因此，处方中添加聚山梨酯20/80，以及部分研究表明添加泊洛沙姆188，添加此类非离子型表面活性剂，对于吸附在硅油-水界面的蛋白，能够在一定程度上起到降低微粒的增加及蛋白聚集的作用，前两者均于上市抗体药物中广泛使用。研究亦表明，在0.001%的浓度下，PS80相比PS20更能抑制蛋白吸附在硅油-水界面，但是提高表面活性剂浓度后，二者则作用相当。

       Kannan等人[4]研究了表面活性剂泊洛沙姆188和PS20通过竞争性吸附在油水界面降低抗体聚集的作用。其中PS20具有更强的表面活性，竞争性吸附作用更强，但是，较低的界面张力和更强的液滴稳定性导致含有PS20的搅拌混合物中存在更多的硅油液滴，增加了单抗吸附的界面面积与聚体的形成。

       Alana Gerhardt等[5]进一步研究认为，当表面活性剂浓度高于临界胶束浓度(CMC)时，PS20通过优先吸附在硅油-水界面上，减少界面诱导的蛋白质聚集；当表面活性剂浓度低于CMC时，PS20与蛋白质的疏水基团相互作用，形成表面活性剂-蛋白质复合物，抑制了界面凝胶形成所必需的蛋白质-蛋白质相互作用，抑制硅油-水界面的吸附蛋白层凝胶化，从而减少颗粒生成。然而，聚山梨酯并非万金油的存在，其本身降解对抗体稳定性所产生的影响也越来越受到各界的关注。

       聚山梨酯是由聚氧乙烯山梨醇的脂肪酸酯组成的两亲性非离子表面活性剂，月桂酸和油酸分别是聚山梨酯20 NF(National Formulary)和聚山梨酯80 NF中的主要脂肪酸成分。近年来有越来越多的报告称吐温降解可能破坏蛋白质药物的稳定性，导致溶液中的亚可见颗粒数增多，蛋白质聚集或氧化。

       吐温的降解方式主要有自氧化、环氧乙烷亚基裂解和脂肪酸酯酶水解。环氧乙烷的自氧化会导致过氧化氢的形成，侧链裂解，最终形成短链酸，如甲酸。吐温氧化形成的过氧化氢已知会引起蛋白质的氧化, 如重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)和重组人神经生长因子(rhNGF)这两种治疗蛋白, 通过添加抗氧化剂如半胱氨酸，硫代甘油和甲硫氨酸来防止氧化。

       脂肪酸酯键裂解（聚山梨酯20为亚油酸、聚山梨酯80为油酸）反应取决于溶液的pH值、氧、过氧化物、热、紫外线和金属离子（如铜）等因素，在室温（25℃）下存储聚山梨酯主要导致脂肪酸酯水解，而在更高的温度下存储也会导致环氧乙烷亚基的自氧化[6]。

       在生物制剂的纯化步骤中，自细胞碎片中分离单克隆抗体(mAbs)时，经常会有极微量乃至低于检测限而几乎无法检测到的宿主细胞蛋白(HCPs)残留在最终药品(DP)中。具有酯酶活性的HCPs可催化聚山梨酯的水解反应，导致不溶性游离脂肪酸(FFA)释放到溶液中。这些脂肪酸可以形成大量可见和亚可见的微粒[7]。

       而如何避免聚山梨酯的降解，除了控制制剂最终药品中HCPs、金属离子类杂质外，对聚山梨酯的采购和使用也有一定的要求。除采购纯度较高的聚山梨酯外，使用过程中，对于大包装的聚山梨酯，如开封后短期无法全部用完，建议分装为小包装，充氮、避光、低温条件下储存，能够降低其氧化降解的速率，也可以通过添加低浓度的抗氧化剂丁基羟基甲苯（BHT）来防止降解。

       参考文献

       [1] JONES et al., Silicone Oil Induced Aggregation of Proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.94:918-927, 2005

       [2] THIRUMANGALATHU et al.,Silicone Oil- and Agitation-Induced Aggregation of a Monoclonal Antibody in Aqueous Solution. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 98, 3: 167-3181, 2009.

       [3] Mehta et al., Gelation of a Monoclonal Antibody at the Silicone Oil-Water Interface and Subsequent Rupture of the Interfacial Gel Results in Aggregation and Particle Formation. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 104:1282-1290, 2015.

       [4] Kanan et al., Adsorption and Aggregation of Monoclonal Antibodies at Silicone Oil-Water Interfaces. Mol. Pharmaceutics 2021, 18, 1656?1665, 2021.

       [5] Gerhardt et al., Surfactant Effects on Particle Generation in Antibody Formulations in Pre-filled Syringes. Journal of Pharmaceutical Sciences, 104(12), 4056-4064. 2015.

       [6] Bruce A Kerwen, Polysorbates 20 and 80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics: Structure and Degradation Pathways. J Pharm Sci. 97(8):2924-35. 2008.

       [7] Roy et al., Polysorbate Degradation and Particle Formation in a High Concentration mAb: Formulation Strategies to Minimize Effect of Enzymatic Polysorbate Degradation. J Pharm Sci. 110(9):3313-3323. 2021.