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       β-catenin、BCL9通路

       与蛋白结构

       自1982年发现第一个WNT1（最初命名为Int-1）基因以来，Wnt信号通路一直是开发新癌症疗法中一个令人兴奋的话题。目前，Wnt信号通路分为经典Wnt（Wnt/β-catenin）信号通路和两个非经典Wnt（Wnt/Ca2+和Wnt/PCP）信号通路。

       研究最多的途径是经典Wnt信号通路（通过β-Catenin激活基因转录），其协调健康胚胎中的组织更新和干细胞增殖、迁移、分化、存活发育和成人组织稳态。Wnt/β-catenin信号传导的异常激活与许多人类疾病密切相关，因为它参与止血功能。

       β-catenin充当细胞质中的分子效应子。然而，当定位到质膜时，β-catenin则充当E-钙粘蛋白和细胞骨架相关肌动蛋白之间的桥梁，在细胞之间形成贴壁连接。

       在没有细胞外Wnt配体的情况下（图1A），β-catenin破坏了由轴抑制蛋白（Axin），肿瘤抑制性腺瘤性大肠息肉病（APC），酪蛋白激酶1α（CK1α），糖原合酶激酶-3β（GSK-3β），E3泛素连接酶β-TrCP和凌乱蛋白（DVL）形成的复合物。在该复合物中，β-catenin的N端结构域S33，S45，S37和T41被CK1α和GSK-3β磷酸化。磷酸化后的β-catenin被β-TrCP泛素化，从而促进了β-catenin的蛋白酶体降解[1]。

       相反，在生理条件下（图1B），细胞外Wnt配体与DVL和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）结合，激活DVL导致LRP6的磷酸化和Axin1的募集，从而抑制β-catenin的磷酸化和随后的蛋白酶体降解。

       β-catenin在细胞质中积聚并易位到细胞核以结合T细胞因子（TCF）或淋巴增强子结合因子（LEF）和几种辅助因子，包括B细胞淋巴瘤 9 （BCL9）；cAMP反应元件结合蛋白（CREB）结合蛋白（CBP）；E1A 结合蛋白300 Da （p300） 和 Pygopus（Pygo 1或2），激活 Wnt 靶标基因的转录来调节细胞增殖、迁移、存活、化疗耐药性和肿瘤免疫逃避。

       图1. Wnt/β-catenin信号传导的机制

       在哺乳动物细胞中，Wnt/β-catenin通路通过一系列胞质蛋白相互作用，使 β-catenin 蛋白在胞质内累积，进而入核传递生长刺激信号。该信号通路一旦出现异常就可能使细胞及生物体的功能产生一定程度的障碍或损坏，进而导致机体肿瘤的发生。目前，Wnt/β-catenin 通路已成为药物发现和开发的主要靶标之一。

       人的β-catenin蛋白由781个氨基酸组成，包括N末端结构域，C末端结构域和包含12个armadillo重复序列（残基141?664）的中央armadillo重复结构域（ARD）。ARD 的N和C端结构域在很大程度上是非结构化的，并不像armadillo重复结构域的那样保守（图2）。

       图2. β-catenin的结构

       据报道，大于20种β-catenin结合蛋白可以与β-catenin的armadillo重复结构域（ARD）结合形成相互作用，并且已经解析出β-catenin与一些结合蛋白（如人APC蛋白，人Axin蛋白，小鼠LEF1蛋白，非洲爪蟾TCF3蛋白，人ICAT蛋白，人TCF4蛋白，人BCL9蛋白以及Wnt信号相关蛋白鼠E-钙粘蛋白和人LHR1蛋白）的晶体复合物结构（图3）。

       图3. β-catenin及其相互作用伙伴

       值得注意的是，通过β-catenin及其核伙伴蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）转录激活靶基因，包括β-catenin/TCF、β-catenin/BCL9、β-catenin/CBP和β-catenin/p300，是Wnt/β-catenin信号传导的最后一步途径，表明破坏这些核复合物可能成为阻断Wnt/β-catenin信号异常激活的最有希望的策略。本文主要介绍破环β-catenin与BCL9蛋白蛋白相互作用的小分子抑制剂。

       人的BCL9蛋白由1394个氨基酸组成，可作为Wnt/β-catenin途径的转录共激活剂。它有三个保守区域：Pygopus结合域HD1，β-catenin结合域HD2和典型的核定位信号肽HD3。

       β-catenin/BCL9复合物在肿瘤组织中占主导地位，但在健康细胞中不占主导地位。此外，抑制BCL9可以减少肿瘤生长，促进CD8+ T细胞肿瘤浸润，增强小鼠CRC模型中对抗PD-1治疗的反应。

       β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用（PPI）接口掩埋了大约 1450 ?2，中等强度的 Kd约0.50 μM。β-catenin/BCL9 PPI 为由大约25个残基螺旋段介导来自 BCL9的两个热点（图 4）。热点区域1包括β-catenin的D162、E163 和D164以及BCL9的H358和R359；热点区域2包括β-catenin的A149、A152、L156、L159、L160、V167、A171、M174 和 L178和BCL9的L366、I369 和 L373。

       图4. β-catenin /BCL9复合物的两个主要热点区域（PDB：2GL7）

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       β-catenin、BCL9的蛋白

       与蛋白相互作用小分子抑制剂

       β-catenin和核伙伴PPI的界面通常较大（约1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶剂），并且具有紧密的结合亲和力（如β-catenin/TCF，具有Ki为7?10 nM），主要由疏水和带电特性主导，这使得使用单个低分子量抑制剂难以阻断 PPI。

       β-catenin/BCL9 PPI 界面要小得多（1450 ?2），并且该 PPI 显示0.5 μM 的中等KD。β-catenin与BCL9相互作用的表面与其他β-catenin结合蛋白相互作用的表面几乎没有重叠，而E-钙粘蛋白（区域V）是唯一已知的结合这种PPI的蛋白质接口。

       尽管开发β-catenin与BCL9的蛋白与蛋白相互作用抑制剂有挑战，但是目前也有一些破坏它们相互作用的抑制剂被报道。

       2012年，Bienz等人通过ELISA筛选47,500种LOPAC/PhytoPure/MRCT化合物，发现天然产物carnosic acid（1）为一种新型β-catenin/BCL9抑制剂。Carnosic acid特异性结合HD2-ARD，它的Ki为3.3 μM。核磁共振和晶体学分析揭示了carnosic acid在前四个ARD处直接结合β-catenin；与BCL9结合位点相邻的固有不稳定α螺旋在β-catenin是与carnosic acid相互作用所必需的（图5）[2]。

       图5. carnosic acid（1）的结构与结合活性

       Ji等人使用ALPHAScreen选择性测定法筛选207种天然产物/LOPACPfizer化合物，发现CP-868388（2），它的Ki为1.2 μM，并且它对β-catenin/BCL9的选择性是 β-catenin/E-钙粘蛋白的44倍，但不抑制反式活化在Wnt/β-连环蛋白信号传导（图6）[3]

       图6. CP-868388（2）的结构与结合活性

       Ji等人基于CP-868388进行进一步药物化学优化，发现了β-catenin/ BCL9相互作用的新型小分子抑制剂CPPAA-30（4），它在AlphaScreen竞争性抑制测定中以3.6 μM的Ki破坏β-catenin/ BCL9相互作用。

       基于细胞的实验显示，CPPAA-30选择性地破坏了β-catenin/BCL9 PPI，同时没有影响β-catenin/E-钙粘蛋白PPI、剂量依赖性抑制Wnt信号反式激活、致癌 Wnt靶基因表达下调，以及靶向选择性地抑制携带异常Wnt信号的癌细胞的生长（图7）[4]。

       图7. CPPAA-30（4）结构和活性

       Ji等人继续优化这类结构得到化合物ZW4864（5），在AlphaScreen测定中Ki 值为0.87 μM，与β-catenin结合并选择性地破坏BCL9和β-catenin之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），同时保留β-catenin/E-钙粘蛋白PPI。ZW4864剂量依赖性抑制β-catenin信号激活，下调致癌β-catenin靶基因，并消除β-catenin依赖性癌细胞。更重要的是，ZW4864表现出色药代动力学性质并有效抑制患者来源的异种移植小鼠模型中的β-catenin靶基因表达（图8）[5]。

       图8. ZW4864（5）的结构和活性

       Ji等人最近也报道了基于ZW4864进行结构优化得到化合物6，它的Ki为2.7 μM。在细胞里β-catenin /BCL9 PPI的影响通过β-catenin/BCL9下拉抑制和Wnt/β-连环蛋白信号反式激活的剂量抑制得到证实（图9）[6]。

       图9. 化合物6的结构以及活性

       近期，Carrasco及其同事还使用HTS鉴定了一种有效的小分子抑制剂C-1（7），该抑制剂显着减少了CRC细胞系的增殖并抑制了CRC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长（图10）[7]。

       图10. 化合物7的结构与活性

       Hoggard等人通过基于生物等排体的片段跳跃方案设计支架4'-氟-N-苯基-[1，1'-联苯]-3-甲酰胺（化合物8），以模拟突出热点的疏水侧链的定位，同时考虑目标蛋白热点口袋的大小以及新生成的配体的生物相容性结构。结合晶体结构，经过优化，最后得到化合物PNPB-22（9），它可以抑制Wnt通路AXIN2, LGR5, LEF1, and cyclic D的mRNA表达，可以明显抑制一些细胞如SW480, HCT116, HT29, MDA-MB-231, MDA-MB-436等增殖（图11）[8]。

       图11. PNPB-22（9）的结构与活性

       Li等人发现一系列3-苯基哌啶衍生物抑制β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用。其中，化合物10表现出最 好的抑制活性，在竞争性荧光偏振测定中它的IC50为0.72 μM，对β-catenin的KD值为0.26 μM。该化合物选择性抑制CRC细胞的生长，抑制Wnt信号反式激活和下调致癌Wnt靶标基因表达（图12）[9]。

       图12. 化合物10的结构与活性

       Zhang等人在EJMC上报道槲皮素衍生物作为新型β-catenin/BCL9蛋白相互作用抑制剂的设计、合成和生物学评价，发现了化合物11，在FP assay它对β-catenin的IC50为2.78 μM，在SPR实验中它对β-catenin的Kd为1.23 μM。它直接与β-catenin结合，并在蛋白质水平和细胞环境中破坏β-catenin/BCL9相互作用。

       C1还有效地抑制了体外结直肠癌，并在抑制CT26和HCT116等过度活跃的Wnt/β-连环蛋白信号细胞方面显示出更好的选择性。他们同时证实C1可以抑制CT26肿瘤在体内的生长，调节肿瘤免疫微环境（图13）[10]。

       图13. 化合物11的结构与活性

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       小结

       理论上，直接破坏β-catenin与其核伙伴（包括TCF，BCL9，CBP和p300）的相互作用可以抑制过度活跃的Wnt/β-catenin信号传导，并提供上述独特优势。

       然而，最近的研究表明，几个报道的直接靶向β-catenin的抑制剂，包括carnosic acid（1)，PNU-74654，UU-T02，PNPB-22（9）和HI?B1，在ITC和DSF测定中与β-catenin ARD没有体外结合。这可能表明这些化合物靶向β-catenin与BCL9结合的瞬时结合位点，这也强调了直接靶向β-catenin的困难。

       总的来说，关于破坏β-catenin与其核伙伴相互作用的抑制剂开发的研究仍处于起步阶段，将这里介绍的抑制剂推向临床应用还有很长的路要走。这种批准过程缓慢的背后有四个主要因素：（1）尽管已经广泛研究了高度进化保守的Wnt/β-catenin信号通路40多年，但尚不清楚它是否可以成功被靶向，并具有可接受的安全性；（2）与传统靶标相比设计选择性和有效的小分子抑制剂仍然有挑战。β-catenin和核伙伴PPI的界面通常较大（约1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶剂），并且具有紧密的结合亲和力（β-catenin/TCF，具有Ki 为 7?10 nM），主要由疏水和带电特性主导，这使得使用单个低分子量抑制剂难以阻断 PPI；（3）报告的小分子β-catenin/TCF和β-catenin/BCL9抑制剂的弱结合亲和力（>100 nM）和基于细胞的活性限制他们的体内评估。β-catenin/CBP抑制剂可以与参与许多转录过程的一般共激活剂CBP结合，这意味着它们不太可能是Wnt途径特异性的；（4）一些已经描述的小分子可能直接与β-catenin结合，但目前的结果无法证实Wnt抑制从β-catenin突变或耗尽的细胞中消失。由于这些原因，β-catenin的成药性仍有待验证。

       许多相关的经验和科学的弯路指导开发β-catenin及其核伙伴PPI的抑制剂，包括以下内容：（1）在结构优化中应考虑PK谱，（2）这些抑制剂应在结合亲和力和细胞活性保持平衡，以及（3）这些抑制剂应治疗多种β-连环蛋白相关适应症。

       破坏β-catenin与其核伙伴的相互作用具有巨大的影响挑战，但该领域的研究应继续基于目前在这些方面的成就目标，包括其高安全性和强效治疗效果。随着该领域的进展，β-catenin相互作用仍然是癌症治疗中极具吸引力的靶标。