导语

       随着生物医药特别是免疫治疗的发展，人源化小鼠得到广泛的应用。人源化小鼠分为转基因人源化小鼠和免疫系统人源化小鼠。转基因人源化小鼠使用方便、重复性好，得到广泛的应用。利用该模型也确有有很多药物进入了临床。但是在使用过程中，业内逐渐发现该体系有以下缺陷：

       • 1. 由于人源化策略不一样或者小鼠遗传背景不一样，实验结果会有差距。

       • 2.人源抗体会在免疫健全小鼠体内产生抗药抗体（anti-drug antibody, ADA）反应，不适于长时间观察抗体药物治疗效果。

       • 3.负责药物半衰期的FcRN分子，Albumin分子有种属差异性。而半衰期又决定了药物的疗效和免疫药物不良反应（irAE）。

       • 4.负责抗体依赖的细胞免疫效应的FcgR分子，有种属差异性。抗体分子的活性化Fc受体（CD16a、CD32a、CD64）和抑制性Fc受体（CD32b）的共同影响。而抗体依赖的细胞活性又跟抗体与抗原的亲和性，肿瘤表面抗原的密度相关。

       • 5.对于研究靶向肿瘤相关抗原（TAA）的ADC药物和多特异抗体药物，需要建立表达人TAA的CDX模型。但是小鼠对TAA没有建立其免疫耐受，TAA容易在体内产生免疫原性。表达TAA的细胞系很容易被体内免疫系统清除。

       • 6.TAA在细胞的表达水平和临床有差异，TAA在细胞上的表达密度和抗体药物与抗原的亲和性影响了抗原药物在临床上的表现。

       • 7.体内荷瘤使用的是鼠源细胞系，缺少PDX模型的异质性和临床相关性。

       • 8.对于复杂的免疫治疗会涉及到多个基因都人源化（如IL12及其受体），因此动物模型开发周期很长。

       • 9.已有的转基因人源化小鼠针对的靶标赛道拥挤，对于新靶点有严重的滞后效应。

       • 10.应用多局限于抗体类研究，对于细胞治疗、治疗性疫苗及其综合免疫治疗（如肿瘤治疗性疫苗联合PD1抗体，免疫治疗联合细胞因子）缺少完 美解决方案。

       因此，野生型小鼠和人源化转基因小鼠多用于前体药物概念性的验证。在进入临床之前，有必要利用免疫系统人源化动物模型再加以验证。对于严谨的药物开发流程，这两种人源化模型可以交互验证。对于免疫系统人源化动物模型国内的应用尚不如国外普遍。下面笔者从介绍免疫系统人源小鼠模型的应用、局限和发展等方面加以介绍。

       携带SCID突变，IL2Rγ基因失活的NOD小鼠缺少内源性的T、B、NK细胞，并且天然免疫细胞的活性也比较低。因此该重度免疫缺陷小鼠模型适合在体内移植各种人肿瘤细胞和重建人源免疫系统。由于人和小鼠免疫系统的差异以及发展各种免疫治疗相关技术（检验点抗体、双特异抗体、CAR-T、mRNA疫苗、溶瘤病毒等）发展的需要，同时生长人免疫系统和人肿瘤组织的双人源化PDX小鼠逐渐成为开发和验证各种肿瘤免疫药物必不可少的工具，如图1可见人源化小鼠的构成及其应用。

图1. 双人源化小鼠的构成及其应用

       PART.01

       小鼠重建人免疫系统的方法

       通过重度免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统大概有以下三种方法：

       01  hPBMC小鼠

       移植了人外周血单核白细胞的hPBMC小鼠，主要用于靶向人T细胞药物的研究。

       02  HSC小鼠

       移植了CD34+HSC细胞的人源化小鼠，即HSC小鼠。HSC细胞可以在体内分化出人T细胞、B细胞及少量髓系细胞。

       03  BLT小鼠

       将人胎胸腺组织植入NSG小鼠的肾包膜下，同时从静脉注射自体胎肝的造血干细胞。该小鼠模型的优点是T细胞的发育经过源于自体胸腺组织的HLA的选择性成熟。目前，该模型主要被用于实验室艾滋病的研究。由于该模型需要的组织和细胞源自流产胎儿，因此，该模型不可能得到大规模的商用。

       目前，hPBMC小鼠和HSC小鼠被广泛用于治疗药物的临床前转化。

       hPBMC小鼠的特点、改进及其应用

       移植了hPBMC的小鼠主要在体内重建了人T细胞，因此该小鼠模型主要用于靶向T细胞的药物。该模型的优点是使用简单、价格便宜，但缺点主要是：

       会在六周后出现移植物抗宿主病（GvHD）引起的死亡；

       在体内重建的免疫细胞类型单一，没有NK细胞和其他髓系细胞。

       这些特点影响了该小鼠模型的实验窗口和应用范围。hPBMC小鼠GvHD疾病的程度既跟不同供体来源的PBMC相关，也跟小鼠品系相关。国内有很多商品化重度免疫缺陷型小鼠（NOD SCID/IL2Rγ^-/-）。有些品牌的免疫缺陷小鼠，人T细胞重建速度较快，但是GvHD出现得比较早。通过敲除小鼠的MHC分子，可以大大延迟GvHD出现的时间，但是T细胞重建的效率也会受到影响。在MHC缺陷的NOD SCID/IL2Rγ^-/-表达T细胞的生长因子也许是一个比较好的方向。hPBMC小鼠的B细胞和髓系细胞比较少也是其主要缺陷之一，而且不能通过过表达一些人细胞因子得到改善。有些基因改造的免疫缺陷小鼠，如表达了人IL15的NVG-IL15小鼠，在移植了人PBMC后，可观察到一定比例的人NK细胞和T细胞的重建。但是，在人PBMC NVG-IL15小鼠中NK细胞的功能有待于进一步验证。另外，根据检测hPBMC小鼠的Treg细胞含量也比较少，因此该模型有待进一步完善。

       hPBMC的小鼠主要应用于测试靶向T细胞的免疫类药物，如免疫检验点抗体和靶向CD3的双特异抗体的体内药效测试。另外，hPBMC小鼠也可用于治疗GvHD疾病相关免疫类药物的开发和树突状疫苗的评估。据Jackson实验室报道，hPBMC小鼠也可以用于测试各种靶向T细胞抗体药物和CAR-T药物引起的炎症反应及细胞因子风暴。

       第一代HSC小鼠的缺陷及其应用

       移植了人HSC CD34+细胞的重度免疫缺陷小鼠可在体内重建出人免疫系统。由于部分鼠源细胞因子跟人源细胞因子不存在交叉反应，因此在第一代的NOD SCID/IL2RγKO小鼠重建的人免疫系统发育不完全，主要以人B细胞（50%-80%）和人T细胞（10%-30%）为主，但髓系细胞（2%-5%）、NK细胞（<1%）和树突细胞（<1%）比例较少。第一代HSC小鼠的优点是没有GvHD疾病，寿命可达到一年。因此，其应用主要是长效研究靶向T细胞的抗体药物，如双特异型抗体和免疫检验点抗体等。现有的移植了HSC的人源化小鼠只是重建了部分免疫系统，不能真实地模拟肿瘤的免疫微环境，无法预测免疫药物在临床上的反应和治疗效果。显然不能适应后PD1时代，创新药物研发的需求。

       PART.02

       若干第二代免疫系统

       人源化小鼠

       通过基因修饰，使得NOD SCID/IL2Rγ^-/-小鼠过表达不同人的细胞因子（如NSG SGM3小鼠、NOG EXL小鼠和NOG IL15小鼠）可以提高免疫系统重建效率，增加髓系细胞、NK细胞或树突状细胞的重建比例。由于这些动物模型表达不同的细胞因子，有不同的表达量，导致在这些小鼠重建的人免疫系统有不同的特点，下面将介绍一下已开发的二代免疫系统人源化小鼠及其特点。

       系列髓系增强型人源化小鼠

       MISTRG小鼠是在Rag2^−/−IL2RＹ^−/−(BRG）小鼠遗传背景上利用内源性启动子生理性表达人GM-CSF、IL-3、M-CSF和TPO，以促进人先天免疫系统的重建。随后，将MITRG小鼠的SIRPα基因人源化，从而产生MISTRG小鼠。在该小鼠模型内重建的人髓系细胞的比例是一代重度免疫缺陷小鼠的3到5倍，可以发育出人类单核细胞、巨噬细胞、常规和浆细胞样DCs的功能群体。然而，在该小鼠完成人免疫系统重建后，小鼠红细胞出现严重的缺损且与人类CD45细胞重建水平密切相关，这导致在健康小鼠身上进行实验的时间缩短到几周时间。此外，MISTRG小鼠对饲养条件比较高，否则繁殖效率比较低（笔者使用经验总结），且尚没有进入商业化。

       NSG™-SGM3小鼠是Jackson Lab开发的，利用CMV启动子表达不同的人类细胞因子、GM-CSF、IL-3和SCF。因此，其表达超生理水平的细胞因子（2000-4000 pg/ml）。该小鼠模型突出特点是在移植脐带血（UCB）CD34+细胞后，人源免疫系统重建速度比较快，T细胞出现得比较早，髓系细胞比例高。另外，在该人源化小鼠体内还发现相当比例的Treg细胞和肥大细胞（Mast Cell）。NSG™-SGM3小鼠的主要缺点仍表现为贫血症。此外，还伴有骨髓衰竭和严重的致命性巨噬细胞活化综合征（MAS），并呈现人类IL-6分泌升高的证据。据记载，在移植CD34+细胞后的第10 到20周之间，小鼠死亡率累积上升。这使得NSG™-SGM3小鼠用于免疫肿瘤学研究具有挑战性。NSG™-SGM3小鼠的应用主要是检测CAR-T引起的细胞因子风暴，另外，支持CAR-Mac细胞在体内的重建。

       NOG™-EXL小鼠是日本CIEA在NOG背景上，利用SV40启动子过表达人GM-CSF 和IL-3。细胞因子表达水平更加柔和，在35到80pg/ml的范围内。huNOG-EXL小鼠也可以成功移植更多的人髓系细胞，但是寿命较人源化的NSG™-SGM3小鼠长。NOG-EXL在CD34细胞移植16周以后会出现炸毛和体重减轻现象，20周以后会逐渐出现死亡。因此，CIEA建议实验在第18周以前完成。另外，该小鼠有被检测到树突状细胞发育，但是Treg细胞还是比较少。因此，该小鼠有待被进一步优化。该小鼠曾被用于验证PD1抗体的抗肿瘤效应，也支持急性髓系白细胞（AML）PDX模型的药效验证。

       以上髓系增强型小鼠被用于治疗性抗体的研究，其特点是天然免疫细胞类型更加丰富，有利于模拟免疫药物对肿瘤免疫微环境的调控，如可以检测到M2-Macrophage、树突状细胞。另外，实验窗口也比PBMC小鼠略长。主要缺点是普遍出现贫血症，寿命仍较人源化NSG小鼠短，而且没有NK细胞的发育。

       人类NK细胞及动物模型

       NK细胞是免疫肿瘤学研究的一个有吸引力的靶点。然而，在大多数人源化小鼠模型中，人类NK细胞的发育和存活受到限制。IL-15是NK细胞群发育、存活和功能的关键细胞因子。在重度免疫缺陷小鼠过表达IL15或者将IL15人源化，有利于人NK细胞的发育和体内增殖。由于基因修饰方法的不同，导致人IL15在不同的小鼠体内有不同的表达量。一般来说，IL15血清浓度在100pg/ml以下，有利于CD34细胞在体内的重建，GvHD疾病不是很严重。而100pg/ml以上则有利于外周血NK在体内的增殖。值得注意的是，过高的IL15体内环境可能会导致NK细胞的耗竭，不利于长期研究NK的抗肿瘤功能。IL15小鼠的主要应用场景是测试抗体的ADCC药效和靶向NK的双特异抗体，其在CAR-NK药效方面的应用仍处于探索阶段。

       hIL2-NOG小鼠

       hIL2-NOG小鼠是CIEA开发的在NOG小鼠过表达人IL2。因为高水平的IL2可以放大T细胞的毒杀作用，因此该模型被认为可以准确预测PD1疗法和TILs疗法在临床的药效。此外，该动物模型也被证明可以有效地预测TCR-T和CAR-T对实体瘤的抑制作用，而且抗肿瘤效果和IL2的表达量正相关。不过，hIL2-NOG小鼠的主要缺陷是IL2表达水平在不同小鼠间差异比较大。每只小鼠的IL2表达量需要单独测定，这可能和CIEA使用CMV启动子和随机插入的转基因策略相关。

       IL-6人源化动物模型

       耶鲁大学的Flavell教授实验室将BRGS小鼠的IL6基因人源化，得到BRGS6小鼠。HSC人源化后的BRGS小鼠被卵清蛋白免疫后可产生针对该蛋白的人IgGs。CIEA开发的hIL6-NOG小鼠在被CD34+HSC细胞移植后，能够有效地重建人单核细胞和巨噬细胞，而且髓系细胞中有相当一部分是HLA-DR低表达的髓系细胞，预示着该模型可能有助于模拟肿瘤免疫抑制微环境。Jackson实验室开发的NSG IL6小鼠被证明与慢性GvHD疾病发生相关。IL-6人源化的动物模型更多用处可能是支持多发性骨髓瘤在体内重建，为多发性骨髓瘤的治疗提供疾病模型。需要指出的是，人IL6可能和小鼠IL6受体存在交叉反应。不同的人源化策略可能导致不同的IL6表达量，过高的IL6水平不利于小鼠的健康。

       人源化FLT3L的模型

       FLT3配体（FLT3L）在包括DCs在内的几种髓系细胞群的发育中起着关键作用。但是人FLT3L可能和鼠源FLT3存在交叉反应，能激活鼠源天然免疫细胞。因此，向FLT3缺陷的CD34+HSC移植SCID小鼠注射重组人FLT3L细胞因子或编码FLT3LG的腺病毒可增加中单核细胞、巨噬细胞和常规浆细胞样DCs和CD56+NK细胞的数量。另有研究表明，将人FLT3L注射到CD34+HSPC植入的NSG-SGM3小鼠中改善了人CD141+DCs的发育，并增强了抗PD-1抗体（单独或与TLR3激动剂一起）的活性，可以抑制黑色素瘤CDXs的生长。FLT3L还被用于生物疫苗研究，注射了FLT3L的FLT3缺陷型NSG HLA A2小鼠可以产生较强的抗原特异性T细胞免疫反应。

       淋巴结的发育

       将免疫系统人源化小鼠应用于生物疫苗的研究，存在的另一个局限是重度免疫缺陷小鼠没有正常的淋巴结发育。重度免疫缺陷小鼠一般有IL2Rγ基因缺陷，该基因也是IL7的受体组成之一。IL-7信号传导对于整个淋巴系统发育和维持至关重要，IL7信号通路的缺陷可导致重度免疫缺陷小鼠淋巴结发育障碍。补救方法之一是在缺陷小鼠体内过表达TLSP基因。TSLP可以代偿和IL-7信号功能的缺失，但是它的受体不需要IL2Rγ基因。过表达鼠源TSLP基因，有助于在免疫缺陷小鼠发育淋巴结。解决淋巴结发育的另一个方案是在淋巴组织诱导细胞（LTi）特异性的表达IL2Rγ基因。有淋巴结和树突状细胞的NSG HLA A2小鼠将是肿瘤疫苗研究有利的工具。利用免疫系统人源化小鼠产生高质量的抗原特异性的抗体，一直是学术界和企业界急迫需要解决的问题之一，拥有淋巴结和B细胞发生中心是其先提条件。

PART.03

浅析未来发展方向

       首先，持续完善人源化免疫系统。免疫系统人源化小鼠对于预测免疫类药物在临床上的反应和疗效，无疑是十分重要的。尽管越来越多的第二代免疫系统人源化小鼠有助于逐步完善人源化免疫系统，但是，没有一只人源化小鼠能概括TME内免疫环境的各个方面。例如，除了T、B和髓系细胞，在肿瘤免疫微环境中还应存在Treg细胞、髓系抑制性细胞（MDSC）、肥大细胞、树突状细胞和中性粒细胞。因此，针对不同的免疫类药物应该定制不同的个性化免疫系统人源化小鼠加以研究。另外，针对髓系增强型小鼠寿命普遍减少的现象，可以采取瞬时表达细胞因子的策略，避免免疫细胞的过度激活。此外，将小鼠的CD47基因人源化，也有望减少贫血症在人源化小鼠中的发生几率。

图2. 完全免疫系统人源化模型建议的基因修饰

       其次，建立抗原特异性免疫反应。大多数实验方法依赖于不匹配的肿瘤和免疫系统的使用。这些异体移植物肿瘤模型已成功用于浸润TME的人类免疫细胞，并研究免疫系统与肿瘤的相互作用。此外，由于HLA不匹配和缺乏支持T细胞发育的人类胸腺上皮，HLA限制肿瘤抗原特异性T细胞的生成具有挑战性。利用肿瘤病人的骨髓细胞或者G-CSF活化的外周血白细胞，在小鼠重建和肿瘤同源的个性化免疫系统在技术上也完全可以实现。移植自体的胸腺上皮细胞，有助于在小鼠体内完成自体HLA依赖的人T细胞的分化和成熟。利用病人的iPS细胞，在体外分化胸腺上皮细胞可替代从病人的胸腺组织用于免疫系统T细胞的成熟。利用iPS分化的CD34细胞也将有助于建立个性化的免疫系统人源化小鼠。这也是今后值得探索的方向。

       完善免疫系统人源化小鼠的关键是增强其在临床转化和药物评估中的应用。利用人源化小鼠评估抗体类药物是其主要应用场景之一，但是由于免疫缺陷小鼠的体内没有B细胞和抗体，导致小鼠髓系细胞上表达的FcγR非特异性地捕捉人源化抗体。这不仅缩短了治疗性抗体的半衰期，还非特异性地激活了鼠源的ADCP反应。鼠源的ADCP效应不仅可以抑制肿瘤，增加了药物评估的假阳性，而且还降低外周血人T细胞的数量产生假阴性。FcγR细胞的存在将影响抗体评估结果的准确性，而且实验差异性比较大。敲除鼠源的FcγR有助于完善抗体药物的临床前评估。

       细胞治疗是免疫系统人源化小鼠的另一个重要应用场景。在这方面的主要问题是很多免疫细胞的体外培养依赖细胞因子，但是免疫缺陷小鼠体内没有提供同样的细胞因子环境，这导致某些治疗免疫细胞，如CAR-NK、UCAR-T、CAR-Mac、CAR-NKT等，在小鼠体内的半衰期比较短，需要不断地注射免疫细胞才能观察到对肿瘤细胞的抑制作用。不同的免疫细胞需要小鼠提供不同的细胞因子生长环境。另外，针对治疗实体瘤细胞，有些免疫细胞（如TILs、TCR-T）等往往需要依赖高浓度的IL2才能观测到结果。这不是说在临床上一定需要高浓度IL2细胞因子才能治疗，而是没有这些细胞因子，在临床前的动物模型上，很难短时间观察到临床上的效应。此外，某些髓系PDX模型也需要体内提供细胞因子，如急性髓系白血病（AML）PDX模型依赖人GMCSF，而多发性骨髓瘤(MM)的PDX模型需要人IL6。相较于实体瘤，细胞治疗在液体瘤上的效果更好。开展针对髓系细胞瘤的细胞治疗的开发，可以避免B细胞瘤赛道过于拥挤。建立髓系细胞瘤的PDX模型是开展相关工作的先提条件。

       随着世界疫情的过去，mRNA疫苗的研究重点会逐渐向肿瘤疫苗倾斜。但是现有的动物模型不能有效地评估肿瘤疫苗。首先，野生型小鼠对人肿瘤相关抗原没有建立起免疫耐受，有时很难有效地建立表达人抗原的CDX模型。其次，肿瘤疫苗在小鼠体内激起MHC限制性的T细胞反应。小鼠MHC限制性的T细胞反应并不能用于衡量抗原和疫苗在人体内的治疗效果。如果肿瘤相关抗原有细胞表面部分表达还会产生体液免疫。而在临床上，肿瘤疫苗的疗效通常是依赖HLA限制性的T细胞免疫。因此，业内急需一种由人的抗原呈递细胞呈递的只引起HLA限制性T细胞免疫反应的人源化小鼠模型，用于肿瘤疫苗的评估。

       最后，可能是免疫治疗精准医学方向。随着十多年肿瘤免疫药物的发展，一个业内共识就是同样的免疫药物对不同的人有不同的疗效和不同的毒副作用。例如，同样选择肿瘤PD-L1高表达的人群，PD1抗体的临床有效性只有30%左右。有些病人对于CAR-T细胞治疗表现出严重的毒副反应和细胞因子风暴，特别严重情况下会出现死亡。临床实验阶段出现死亡事件将大大延缓治疗药物的审批速度。如何利用人源化小鼠在短时间内预测病人对不同免疫药物的响应性和细胞毒 性反应，将成为以后应用的重点。利用人源化小鼠挑选对免疫药物敏感且安全的病人，是临床药物临床前评估和随后临床治疗必不可少的手段，未来这方面的市场将十分广阔。

       结      语

       总之，同转基因人源化小鼠一样，免疫系统人源化动物模型在创新药物开发和临床精准治疗等方面也十分重要和必要。随着生物医药的发展和创新，更多人源化动物模型的开发及其应用也需要不断的完善。这需要国内政府、科研机构、资本和医药公司等多平台的共同努力。

       ●关于未来模式●

       未来模式苏州生物科技成立于2021年，是由海外团队与苏州本地的科学家联合发起的生物医药服务外包企业。同年底，未来模式创业团队入选苏州工业园区领军人才政策。公司将致力于为医药企业、临床医院和科研用户提供各种体内生物医药开发和评估的工具，为精准医学和转化医学项目提供解决方案。目前，未来模式已经开发了几十种第二代免疫系统人源化动物模型。正在进行功能测试，部分产品如表1。

       表1. 未来模式开发的部分人源化动物模型

       未来模式苏州生物科技有限公司开发了长效的细胞因子递送技术，可以在NV-NSG小鼠长效表达多种人细胞因子，如 IL3、GM-CSF和IL15，因此进行HSC重建免疫系统之后，除了常见的人T和B细胞，还同时大幅提高了NK细胞、髓系细胞的比例。NV-NSG Plus3小鼠免疫系统重建过程及其重建结果见图3。经过详细分析，重建的免疫系统里还发现相当比例的髓系来源的抑制性细胞（MDSC）（因篇幅，数据略）。另外，由于采用化学清髓和外源表达细胞因子策略，在免疫系统人源后，小鼠寿命也没有受到到严重影响。人源化NV-NSG Plus3的生命周期远超其他二代免疫系统人源化小鼠，如图4。拥有完全免疫系统的HSC NV-NSG Plus3小鼠模型适合长期体内综合评估和模拟免疫类药物在临床上的反应和疗效。拥有更多细胞因子的免疫系统人源化小鼠还在开发之中。并且未来模式还可为不同的客户定制不同的免疫系统人源化动物模型。

       图3. NV-NSG plus3免疫系统重建过程和重建结果

       图4. 人源化NV-NSG Plus3小鼠和其他第二代人源化小鼠的寿命比较

       作者介绍

       黄菁博士

       黄菁博士中科院北京动物所博士毕业，北京大学医学部博士后，师从童坦军院士。此后，先后在爱因斯坦医学院，何大一院士领导的洛克菲勒大学附属艾伦戴蒙艾滋病研究所，哥伦比亚大学进行免疫学研究。在Science Translational Medicine等杂志发表学术文章30余篇，其中第一作者10篇，一作单篇最高引用次数接近200次。

       黄菁博士主要研究方向是免疫类相关动物模型的开发及其在生物疫苗评估中应用。曾经联合世界五百强Leidos公司开发新型免疫佐剂——PD1阻断短肽，为美国科技新锐NovaVax评价其抗疟疾疫苗，利用免疫系统人源化小鼠为法国巴斯德研究所验证其靶向树突状细胞的纳米疫苗。

       2019年，黄菁博士在美国纽约成立Genomab生物科技有限公司。2021年，回国创业。在苏州成立未来模式苏州有限公司，主要从事各种免疫系统人源化动物模型及人源化抗体转基因动物模型的开发和应用。

       目前，黄菁博士及其创业团队正在积极对接商业投资机构，寻求科学和商业合作伙伴将人源化动物模型产业化。