尽管多肽在安全性和选择性方面具有天然优势，但它的阿喀琉斯之踵（原指阿喀琉斯的脚后跟，因是其身体唯一一处没有浸泡到冥河水的地方，成为他唯一的弱点。阿喀琉斯后来在特洛伊战争中被毒箭射中脚踝而丧命。现引申为致命的弱点、要害）在于其较差的类药性，易受酶促降解、肾 脏清除和受体介导的快速清除的影响，从而导致血浆消除半衰期较短。此外，肠胃外给药的方式给患者带来不适和不便，这可能会对依从性产生负面影响，并最终限制治疗效果。

       针对多肽在这些方面的缺陷，研究人员开发了很多相关技术进行弥补，其中最突出的当属多肽的脂质化（lipidation）修饰。Nature Reviews Drug Discovery在最近的一篇文章Derivatization with fatty acids in peptide and protein drug discovery对此进行了详细的综述[1]。

       脂肪酸衍生化的基本原理

       生理脂质化本身是一种普遍存在且多样化的翻译后和共翻译过程，涉及以不同方式与蛋白质连接的各种类型的脂肪酸，从而为蛋白质提供独特的特性。

       脂肪酸衍生后的皮下注射肽药物可能在注射部位保留更长时间，因为脂肪酸侧链会降低在注射部位的扩散速率，得益于脂肪酸与质膜和注射部分的白蛋白的结合（albumin，一种大型多功能转运蛋白。由于白蛋白含量丰富、半衰期长以及结合和转运脂肪酸和内源性激素的功能，它成为了多肽类药物的理想载体）。由于白蛋白-多肽复合物的尺寸较大，注射后组织中的扩散速率和毛细血管壁上的通常会降低[2]。

       除此之外，脂质化修饰导致多肽药物分子疏水性增加，从而加强了分子之间的自缔合（self-association），这会降低皮下组织的吸收率，导致通过组织和毛细血管壁的扩散速度变慢[3] 。分子量大于16kDa的蛋白质也可以通过淋巴途径吸收[4]。进入系统循环的脂化多肽，由于与白蛋白之间的可逆、高亲和结合，提高了多肽药物的药代动力学特征，降低大尺寸多肽的肾 脏清除，并降低分配到血管外隔室的速率[5]。

       影响脂质化的因素

       1  脂肪酸

       长烷基链形式的一元脂肪酸具有一个长碳氢链和一个端基羧酸基团，在一定范围内，其与白蛋白结合的亲和力随烷基链的长度而增加[6]。后来，脂肪二酸类型被引入，提供更强的白蛋白亲和力。由于引入了额外的羧酸基团，因此可能导致更长的半衰期[7]。白蛋白亲和力与脂肪单酸或二酸的长度密切相关。1,18-十八烷二酸（1,18-Octadecanedioic acid , C18二酸）和 1,20-二十烷二酸（1,20-eicosanedioic acid , C20二酸）是迄今为止测试过的对白蛋白具有最高亲和力的脂肪酸（图1）[8]。

       图1. C18二酸和C20二酸化学结构

       脂肪一元酸的疏水性高于脂肪二酸，这会影响衍生分子的溶解度、受体药理学和生物物理性质。脂肪单酸衍生化将使衍生后的蛋白质与细胞膜结合并促进内吞[9]。相比之下，脂肪二酸具有增加溶解度的未缩合羧基，并且脂肪二酸衍生的肽更不容易与细胞膜结合并内吞[10]。因此，使用脂肪二酸通常可以更好地维持体内功效，因为目标肽或蛋白质不会因与细胞表面的疏水相互作用而导致丢失或内化。连接的脂肪酸类型可能影响受体特异性。肽或蛋白质的体外和体内功效可能会受到不同程度的影响，具体取决于所连接的是脂肪单酸还是脂肪二酸。

       图2. C18二酸的四唑和磺酸类似物化学结构

       脂肪二酸中远端游离羧基的最重要效果，在于它赋予了更高的白蛋白结合亲和力，因此具有更长的半衰期。此外据报道，具有远端磺基或四唑基（均为羧酸的电子等排体isostere）的脂肪二酸类似物（图2），以高亲和力与白蛋白结合并延长肽或蛋白质的作用曲线[11]。不过对于某些肽来说，与羧基类型的二酸相比，这些电子等排体似乎没有增加任何主要优势。看来影响白蛋白结合的深层次原因，还需要进一步地研究。

       2 脂质化修饰位置

       脂肪酸在蛋白质或肽骨架中的位置，对于最 佳效力和半衰期非常重要。尤其是当脂肪酸直接修饰到主链时（例如通过酰化赖氨酸侧链的氨基）。但当一个诸如谷氨酸这样的spacer结构插入脂肪酸和多肽主链之间时，多肽主链对于与白蛋白的结合力的影响就有可能会变小。在一项研究中发现，脂肪酸衍生的hGH（人生长 激素）与人白蛋白复合物中的X射线结构显示了两个结合位点，均不涉及肽主链[12]。

       除了脂肪酸类型和修饰位点之外，连接脂质与多肽的接头和手臂结构（arm linker）对于衍生后的多肽药代动力学特征也有很大的影响，篇幅原因具体内容本文不做详细介绍。

上市及在研脂化多肽

       最著名的脂化多肽当属司美格鲁肽（semaglutide）、利拉鲁肽（liraglutide）和替尔泊肽（tirzepatide）了。

       1 司美格鲁肽

       图3. 司美格鲁肽（semaglutide）结构式

       司美格鲁肽（图3）是一个GLP-1类似物，是GLP-1受体激动剂多肽，针对2型糖尿病和肥胖症。司美格鲁肽第26位的赖氨酸被硬脂酸二酸（C18 diacid）修饰，增加其与血液白蛋白的结合，从而延长在血液循环中的存在时间。在硬脂酸二酸和赖氨酸之间，还存在一个由谷氨酸和2-（2-(2-氨基乙氧基)乙氧基）乙酸二聚物组成的spacer。司美格鲁肽在血液中的半衰期约为7 天（165-184小时）[13]。它可以通过每周一次皮下注射（Ozempic®）或每天一次口服给药（Rybelsus®）。

       2 利拉鲁肽

       图4. 利拉鲁肽（Liraglutide）结构式

       利拉鲁肽（Liraglutide，Victoza®，Saxenda®）是一种GLP-1类似物，用于治疗2 型糖尿病、肥胖症和预防与糖尿病相关的心血管并发症。利拉鲁肽的Lys26侧链偶联着一个C-16脂肪酸（亦称棕榈酸palmitic acid或软脂酸），之间通过一个谷氨酸spacer连接（图4）。这个棕榈酸修饰，使利拉鲁肽能够与皮下组织和血液中的白蛋白可逆地结合，并随时间缓慢释放。同GLP-1相比，与白蛋白的结合导致利拉鲁肽在肾 脏循环中的降解减慢和消除减少。

       3 替尔泊肽

       图5. 替尔泊肽（Tirzepatide）结构式

       替尔泊肽（Tirzepatide，Mounjaro®）是礼来的2型糖尿病多肽药物，是GLP-1/GIP受体共激动剂，通过皮下注射每周给药一次。替尔泊肽是人类GIP（glucose-dependent insulinotropic peptide, 葡萄糖依赖性促胰岛素多肽）的类似物，附有C20脂肪酸二酸部分，用于优化化合物的摄取和代谢[14]。脂肪二酸部分（二十烷二酸）通过谷氨酸和两个（2-（2-氨基乙氧基）乙氧基）乙酸单元，连接到赖氨酸残基的侧链（图4）。这个脂质化修饰产生了更长的半衰期，并延长剂量之间的时间，替尔泊肽的半衰期约为5天[15]。

       除了利拉鲁肽、司美格鲁肽和替尔泊肽之外，其它常见的多肽脂质化修饰示意图见下图。

       图6. 常见多肽脂质化修饰示意图，来源：Nature Reviews Drug Discovery

       脂肪酸衍生化的机制

       多肽或蛋白质药物药代动力学延长技术的选择，取决于预期的给药途径和相关的消除途径。脂化技术在许多情况下可能很有用，因为相对于聚乙二醇衍生，它具有良好的化学特征。此外，该技术有可能影响皮下给药后的吸收率和各种清除途径的消除率。下图显示了各种延长原则和策略。

       图7. 脂肪酸衍生化能够延长肽和蛋白质药物半衰期的部分机制示意图，来源：Nature Reviews Drug Discovery

       德古胰岛素（insulin degludec）是一种用C16脂肪二酸衍生的类似物（图6），在制剂缓冲液中形成二聚化的六聚体（di-hexamer）。一旦注入皮下组织，二六聚体就形成多聚六聚体（图7）。

       利拉鲁肽和司美格鲁肽是胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物。利拉鲁肽的赖氨酸侧链偶联了一个C16脂肪单酸（棕榈酸palmitic acid）; 司美格鲁肽的赖氨酸侧链接受了一个C18脂肪二酸的修饰（图6）。利拉鲁肽在制剂缓冲液中形成七聚体，一旦注射，利拉鲁肽单体就会从七聚体中缓慢解离并与白蛋白结合。解离的一些利拉鲁肽单体，可能通过单酸侧链锚定在细胞膜中（图7）。

       对于德谷胰岛素和利拉鲁肽，从皮下组织经血液进入组织的分布过程中的决速步 （rate-limiting step）是单体的释放，从而导致触发器动力学（flip-flop kinetics）。在脂肪二酸的促进下，司美格鲁肽强烈结合白蛋白，保护其受蛋白酶降解。在血液中，得到白蛋白荫护的司美格鲁肽形成了储库，其从中缓慢释放。非白蛋白结合分子可以通过非受体介导的途径消除，也可与靶受体结合以引发其生物学作用，然后被消除。如果空间参数允许的话，多肽-白蛋白复合体也可以与靶受体结合，并触发生物学功效（图7）。

       多肽-白蛋白复合体也可以通过白蛋白部分与新生儿Fc受体（FcRn）结合，并以此实现回收再利用，从而进一步延长衍生分子的循环时间（图7）。

       小   结

       脂质衍生化是一种经过临床验证的化学修饰技术，可用于优化多肽和蛋白质药物的药理特性。该技术提供了延长天然分子固有的短半衰期的方法，以便能够每天、每周甚至更长时间地给药间隔。

       此外，脂肪酸衍生化可用于促进生物药物的口服递送，并可能改变它们在组织中的分布。多肽脂质化安全且有效，它还可以通过各种药物化学方法进行优化，且允许具有成本效益的大规模生产。总而言之，脂化衍生已成功地应用于药物工程，并且可能在推动多肽药物开发中，发挥越来越重要的作用。

       参考资料：

       [1] Kurtzhals, P. et al. Derivatization with fatty acids in peptide and protein drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 2023, 22, 59–80.

       [2] Gradel, A. K. J. et al. Factors affecting the absorption of subcutaneously administered insulin: effect on variability. J. Diabetes Res. 2018, 1205121.

       [3] Mosekilde, E. et al. Modeling absorption kinetics of subcutaneous injected soluble insulin. J. Pharmacokinet. Biopharm. 1989, 17, 67–87.

       [4] Richter, W. F. et al. Mechanistic determinants of biotherapeutics absorption following SC administration. AAPS J. 2012, 14, 559–570.

       [5] Harris, J. M. et al. Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Clin. Pharmacokinet. 2001, 40, 539–551.

       [6] Spector, A. A. Fatty acid binding to plasma albumin. J. Lipid Res. 1975, 16, 165–179.

       [7] Lau, J. et al. Discovery of the once-weekly glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogue semaglutide. J. Med. Chem. 2015, 58, 7370–7380.

       [8] ®stergaard, S. et al. The effect of fatty diacid acylation of human PYY3–36 on Y2 receptor potency and half-life in minipigs. Sci. Rep. 2021, 11, 21179.

       [9] Nelson, A. R. et al. Myristoyl-based transport of peptides into living cells. Biochemistry. 2007, 46, 14771–14781.

       [10] Gao, X. et al. Fatty acylation enhances the cellular internalization and cytosolic distribution of a cystine-knot peptide. iScience. 2021, 24, 103220.

       [11] Poulsen, C. et al. Rational development of stable PYY3–36 peptide Y2 receptor agonists. Pharm. Res. 2021, 38, 1369–1385.

       [12] Johansson, E. et al. Identification of binding sites on human serum albumin for somapacitan, a long-acting growth hormone derivative. Biochemistry. 2020, 59, 1410–1419.

       [13] Kapitza, C. et al. Semaglutide, a once-weekly human GLP-1 analog, does not reduce the bioavailability of the combined oral contraceptive, ethinylestradiol/levonorgestrel. Journal of Clinical Pharmacology. 2015, 55, 497–504.

       [14] Ahangarpour, M. et al. Photo-induced radical thiol-ene chemistry: a versatile toolbox for peptide-based drug design. Chemical Society Reviews. Royal Society of Chemistry. 2021, 50, 898–944.

       [15] Frias, J. P. Tirzepatide: a glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) dual agonist in development for the treatment of type 2 diabetes. Expert Rev Endocrinol Metab. 2020, 15, 379-394.

       专栏作者

       哥哈骎

       南开大学本科、硕士，德国比勒菲尔德大学博士。多肽化学、多肽API GMP生产专家、欧洲制药公司首席科学家；

       拥有Lean Six Sigma黑带认证；

       著有专著《Side Reactions in Peptide Synthesis》。