靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作为一种新兴的治疗策略被广泛关注，它可以靶向以前被认为“不可成药”的蛋白质。PROTAC是TPD的主要焦点，它同时招募并结合E3连接酶和靶蛋白(POI)，从而形成E3-降解蛋白POI三元复合物，诱导POI泛素化和随后的蛋白体降解。

       鉴于PROTAC巨大的治疗潜力和独特的机制，该领域引起了学术界和制药行业的极大兴趣，目前已有250种药物被PROTACs进行降解测试。尽管PROTAC具有广泛的治疗潜力，但在人类基因组的数百种E3连接酶中，目前只有不到2%的E3连接酶参与了TPD领域的研究，因此，需要招募更多的E3连接酶来进一步增强TPD的治疗潜力。

       近日，美国国家癌症中心的Eytan Ruppin教授和印第安纳大学医学院生物统计与健康数据科学系Leng Han教授团队研究人员对1075个E3连接酶进行了表征，最终确定了76种有潜力的E3连接酶，扩展了PROTAC的E3连接酶版图，推动了PROTACs药物的开发进展。

       研究人员收集了E3连接酶的综合列表(图1a)，并利用大规模数据资源、实验证据和人工智能(AI)工具来描绘E3连接酶的七个不同的关键维度：

       化学配位性，表征E3连接酶的粘合剂可用性;

       E3连接酶在肿瘤和正常样本中单细胞水平和整体水平的表达模式;

       进一步表征其潜在蛋白靶点的E3连接酶的PPI;

       在PROTAC设计中应优先考虑的其他重要因素，包括结构可用性、功能必要性、细胞定位和E3连接酶的PPI接口(图1b)。

       之后，他们基于三十个大规模数据集分析，包括3个E3连接酶列表、5个配体库、5个表达图谱、7个互作数据库、2个结构数据库、2个重要性筛选、3个细胞定位数据库和3种互作界面数据库，研究人员揭示了几种有前途的现存的E3连接酶。

       PART.

       01

       化学配位性

       表征E3连接酶的粘合剂可用性

       为了寻找可能促进E3连接酶募集的新的药物，研究人员采用基于深度学习的虚拟筛选配体模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3连接酶与药物之间潜在的相互作用。

       在评估和应用该模型后，研究人员获得了预测的药物-靶标相互作用，包括潜在的新型E3连接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，与关键肿瘤驱动因子TP53和APC32具有ppi，并预测与DB13955(雌 二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用这些药物可能会增加潜在的新型E3连接酶的配体性，从而靶向其他肿瘤靶点。他们系统分析利用了五个大规模的数据源，并揭示了许多新的E3连接酶和数十种可用的配体，这些配体可能用于PROTAC的开发。

       PART.

       02

       E3连接酶在肿瘤和正常样本中

       单细胞及整体水平的表达模式

       通过对肿瘤和正常组织的整合分析，研究人员确定了206个E3连接酶，包括3个增选的和203个新的E3连接酶，它们在TCGA和HPA病理中至少一种肿瘤类型中高表达，而在GTEx和Tabula及大多数正常组织中低表达。除了这3种被采用的E3连接酶，这203种潜在的新型E3连接酶揭示了一个大型的E3连接酶库，可用于抗癌PROTAC的开发。

       研究人员全面描绘了大细胞水平和单细胞水平的转录组表达，以及E3连接酶的蛋白质组表达，证明了利用大规模表达数据进一步推进PROTAC提高疗效和规避副作用的必要性。

       PART.

       03

       E3连接酶与POI蛋白

       相互作用(PPI)的综合图谱

       蛋白质被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而异，总结E3连接酶相关的ppi应优先考虑能被PROTAC高降解的靶蛋白。为了确定这些PROTAC靶点，研究人员将PROTACtable基因组和基于模型的蛋白质降解性分析(MAPD)两项研究的结果结合起来，对靶点的PROTACtable可降解性进行了评估。这两项研究突出了3280个PROTAC可处理靶点，其中1025个靶点重叠。

       研究人员还发现了一些PPIs涉及PROTAC可治疗的癌症靶点，这些靶点尚未在PROTAC中被探索。例如，神经母细胞瘤RAS(NRAS)与转移性结直肠癌的不良预后相关，有证据表明PPIs具有增选的E3连接酶BIRC2和XIAP，以及潜在的新型E3连接酶CDC20和SKP2。另一个PROTAC可处理的靶点是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它诱导乳腺癌的化疗耐药，与增选的E3连接酶MDM2和XIAP以及潜在的新型E3连接酶ITCH和SMURF2相互作用。在开发针对这些癌症靶点的PROTACs时，可以考虑相应的E3连接酶。

       PART.

       04

       E3连接酶的结构可用性、

       功能必要性、细胞位置和PPI接口

       首先，为了获得E3连接酶的可用蛋白质结构，研究人员查询了世界范围内的结构数据库protein Data Bank (PDB)，鉴定出414个具有实验确定结构的E3连接酶。这些可用的蛋白质结构，为招募潜在的新E3连接酶提供了很好的机会。

       然后，研究人员利用依赖图谱(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技术，研究了E3连接酶的遗传扰动，评估了癌细胞系中基因的必要性。他们在CRISPR筛选中鉴定出146个肿瘤必需的E3连接酶，包括两个增选的E3连接酶——VHL和RNF4。

       紧接着，为了确定E3连接酶的细胞位置，研究人员整合了来自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高质量数据。发现983个E3连接酶被细胞质和/或细胞核注释，这被认为是PROTAC的首选位置。这些潜在的新型E3连接酶，为实现受限或需要降解的亚细胞定位提供了一种通用的选择。

       最后，研究人员从多种来源收集到跨越928个E3连接酶，包括11个增选的E3连接酶的PPI界面。基于此可以指导人们确定E3连接酶或靶标中观察到的突变是否位于界面区域，从而可能进一步破坏E3连接酶与靶标的相互作用。

       PART.

       05

       局限与展望

       然而，此研究目前也有一定的局限性，首先针对E3连接酶的研究主要集中在有限数量的E3连接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白经验；其次由于目前缺乏大规模的单细胞蛋白质组学数据，无法更高分辨分析E3连接酶的活性，最后翻译后修饰(PTM)在调节E3连接酶的活性和丰度（丰度指的是E3连接酶的相对含量）方面也起着关键作用。

       PTM对PROTAC中E3的调控作用在很大程度上是未知的，大规模的高分辨率PTM数据还无法实现。因此，该网站为用户提供了根据他们的偏好选择数据源的选项。除了为PROTAC寻找新的E3连接酶外，E3连接酶的信息也可以被其他TPD领域所利用，如蛋白水解靶向抗体(PROTAB)和分子胶。

       总之，该研究通过分析30个大规模数据集，从7个不同的方面系统地表征了E3连接酶，包括化学配体性、表达模式、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)、结构可用性、功能必要性、细胞位置和PPI接口。揭示了几种有前途的现存的E3连接酶。综合置信度评分、配位性、表达模式和PPI，确定了76个E3连接酶作为PROTAC相互作用的候选酶。

       此外，尽管新开发的PROTAC大部分用于癌症治疗，但研究人员对E3连接酶的综合分析也可以从癌症转移到其他领域的治疗开发，例如：治疗神经和/或免疫疾病。期待E3连接酶能够持续助力PROTAC药物的开发，造福更多患者！