金笔奖|克拉霉素微生物限度检查方法学验证

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作者：昔年来源：CPHI制药在线

2023-12-16

建立克拉霉素微生物限度检查方法。根据试验结果，克拉霉素对细菌抑菌作用强，特别是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，必须采用均质袋并通过薄膜过滤法去除克拉霉素的抑菌作用，各试验菌的回收率达到50%以上。该方法可用于克拉霉素微生物限度检查。

摘要：建立克拉霉素微生物限度检查方法。根据试验结果，克拉霉素对细菌抑菌作用强，特别是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，必须采用均质袋并通过薄膜过滤法去除克拉霉素的抑菌作用，各试验菌的回收率达到50%以上。该方法可用于克拉霉素微生物限度检查。

克拉霉素为属大环内酯类抗生素，对革兰阳性菌，部分革兰阴性菌及支原体有抑制作用，临床主要用于抗感染治疗。《中国药典》2020年版规定，1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法用于检查非无菌制剂及其原辅料等是否符合相应的微生物限度标准。本文采用五种菌作为阳性对照菌，测其回收率，建立克拉霉素微生物限度检查方法。

1.试验材料和仪器

1.1供试样品：克拉霉素，批号：A、B、C

1.2培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：20220614，厂家：青岛日水生物技术有限公司；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：20221125，厂家：青岛日水生物技术有限公司；胰酪大豆胨液体培养基，批号：202308703，厂家：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；沙氏葡萄糖液体培养基，批号：20210914，厂家：青岛日水生物技术有限公司；pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，批号：20230323，厂家：青岛日水生物技术有限公司；0.9％无菌氯化钠溶液：批号：2304011301，厂家：石家庄四药有限公司。

1.3试验菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

1.4仪器：鑫贝西生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X；永生生化培养箱SHH-500L。

2.需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

克拉霉素为抗生素类药物，具有较强的抑菌活性，根据《中国药典》2020年版1105非无菌产品微生物限度检查，本品采用薄膜过滤法进行试验。

2.1菌液制备

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养18～24h；取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，23℃培养2～3d。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经23℃培养5～7d，加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。各试验菌的接种量不大于100cfu。

2.2供试液的制备

取供试品10g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，制成10^-1供试液。取10^-1供试液10ml，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，制成10^-2供试液，取10^-1供试液10ml，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，制成10^-3供试液。

2.3薄膜过滤法（常规方法）

2.3.1试验组：取10^-2供试品10ml，分别加入各试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml。

2.3.2菌液组：以稀释剂代替供试液，按试验组操作加入各试验菌。

2.3.3供试品对照组：取10^-2供试品10ml，以稀释剂代替菌液同试验组操作。

2.3.4试验菌回收率的计算：

回收率=[（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液组菌落数]×100%

2.3.5结果判断：试验菌回收率不低于50%，符合验证试验，可按照此方法进行需氧菌、霉菌和酵母菌的微生物计数，若试验菌回收率低于50%，应消除供试品的抑菌性，并重新进行方法实验。

2.3.6克拉霉素通过薄膜过滤法，需氧菌总数检查试验菌回收率结果，见表1；霉菌和酵母菌总数检查试验菌回收率结果，见表2。

表1 需氧菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法）

试验次数	菌种名称
试验次数	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌	枯草芽孢杆菌	白色念珠菌	黑曲霉
1	0	0	0	81.3	79.7
2	0	0	0	85.3	90.3
3	0	0	0	84.2	86.1

表2 霉菌和酵母菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法）

试验次数	菌种名称
试验次数	白色念珠菌	黑曲霉
1	84.4	81.8
2	89.5	86.7
3	77.4	83.6

由表2所示，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%，此方法适用于霉菌和酵母菌计数，但是由表1可以看出，虽然白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%，而金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的回收率为0%。由此可见，克拉霉素对细菌有较强的抑菌作用，应建立新的方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行试验。

2.4薄膜过滤法（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量）

2.4.1试验组：取10^-3供试品10ml，加入试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，采用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，每次冲洗量为100ml，总冲洗量分别为300ml、500ml、800ml。

2.4.2菌液组、供试品对照组均同法操作。

2.4.3克拉霉素薄膜过滤法（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量），细菌试验菌回收率结果，见表3。

表3细菌试验菌回收率（采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量）

总冲洗量	菌种名称
总冲洗量	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌	枯草芽孢杆菌
300ml	0	70.8	0
500ml	0	90.2	0
800ml	20.6	95.7	40.5

由表3所示，采用最高的稀释级别10^-3供试液10ml进行薄膜过滤，冲洗量为300ml，铜绿假单胞菌的回收率在50%以上；而总冲洗量为800ml时，金黄色葡萄球菌回收率仅为20.6%，枯草芽孢杆菌的回收率为40.5%，仍低于50%，需要重新建立方法进行验证。由此可见，克拉霉素对细菌抑菌作用强，特别是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

2.5薄膜过滤法（采用均质袋）

2.5.1供试液的制备：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，并置含滤网的均质袋中，使分散均匀，制成10^-1供试液。取10^-1供试液10ml，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，制成10^-2供试液。依上述方法制成10^-3供试液。

2.5.2试验组：取10^-3供试品10ml，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，再分别加入试验菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml。

2.5.3菌液组、供试品对照组均同法操作。

2.5.4克拉霉素通过薄膜过滤法（采用均质袋），需氧菌总数检查方法试验菌回收率结果，见表4。

表4需氧菌总数检查方法试验菌回收率（薄膜过滤法采用均质袋）

试验次数	菌种名称
试验次数	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌	枯草芽孢杆菌	白色念珠菌	黑曲霉
1	56.3	92.6	62.3	97.4	94
2	54	94.5	67	95.3	96.6
3	60.4	96.1	58.9	102	90.7

由表4所示，采用均质袋，联合薄膜过滤法，各试验菌的回收率均高于50%，说明此方法消除供试品的抑菌活性，因此可采用均质袋并通过薄膜过滤法进行克拉霉素的需氧菌计数。

3.控制菌检查方法的验证

3.1供试液的制备：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，并置含滤网的均质袋中，使分散均匀，制成10^-1供试液。

3.2试验组：取10^-1供试品10ml，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，再加入大肠埃希菌（不超过100cfu）混匀，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml，抽滤，取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基,33℃培养18～24小时，依法检查。

3.3阳性对照组：取不超过100cfu大肠埃希菌至400ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。

3.4阴性对照组：以稀释剂代替供试液照相应的控制菌检查法检查。

3.5试验结果：试验组、阳性对照组检出大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。

4 结果

根据上述试验结果，克拉霉素的微生物限度检查采用下列方法，取供试品10g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，并置含滤网的均质袋中，使分散均匀，制成10^-1供试液，依次制成10^-2、10^-3供试液，需氧菌总数：取10-3供试品10ml，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml；霉菌和酵母菌总数：取10-2供试品10ml，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml；控制菌检查：取10-1供试品10ml，加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，进行薄膜过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次冲洗量为100ml，取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基，依法检查大肠埃希菌。

5 讨论

微生物的生长受许多因素的影响，特别的药品中污染的微生物。一些药物自身具有抑菌作用，因此建立其微生物限度检查方法时，应考虑采用适合的方法消除供试品的抑菌活性。克拉霉素对细菌具有较强的抑菌作用，本文试验供试品制备时，采用含滤网的均质袋，使药品分散均匀，吸取供试液加入到稀释剂中，再进行薄膜过滤，并冲洗，联合作用下去除了克拉霉素的抑菌活性，提高了克拉霉素微生物污染菌的检出。

作者简介：@昔年，检验员，从事药品检验工作六年，对工作积极热情，期待自己能在本职岗位不断进步，放光发热。

参考文献

[1] 中国药典[S].四部,2020;通则1105、1106

[2] 杨薇. 盐酸西替利嗪片微生物限度检查方法的建立[J].中国保健营养,2017, 27(17);116-117