长期以来，多肽药物开发最重要的目标被定为最高亲和力、受体选择性和抗酶降解稳定性。然而在满足生物活性的基础上，多肽药物的递送方式逐渐成为了行业的研究热点，尤其是口服活性肽已经成为了追求的新目标。生产口服活性肽需要双重优化过程：1) 优化亲和力和选择性；2) 优化口服有效性。为了合理设计口服活性肽，必须依次满足这两个条件。

       多肽的化学改性对于实现口服制剂的开发影响重大，这篇文章重点介绍了已经上市或处在临床阶段的口服多肽制剂，希望透过这些成功的经验，指导人们应该从什么角度进行多肽的化学修饰，以同时满足多肽潜在药物的生物活性和口服生物利用度。

       Cyclosporine A (CsA, 环孢素A)

       真菌代谢物环孢素A (CsA) 由Sandoz在上世纪60年代末发现。CsA是一个包含7个N-甲基化氨基酸残基的十一元环肽。CsA由占绝 对优势的疏水性氨基酸组成，它作为一种口服免疫抑制剂，以Neoral?的商品名称得到批准上市。除了用于移植时免疫抑制外，Neoral?还可用于治疗牛皮癣、严重异位性皮肤炎（severe atopic dermatitis）、坏疽性脓皮病（pyoderma gangrenosum）、慢性自体免疫荨麻疹（chronic autoimmune urticaria）、类风湿性关节炎和其他的相关疾病，但通常只用于比较严重的疾病。在美国常做成眼用乳剂治疗干眼症。

       由于其高度的疏水性，CsA在纯溶液配方中口服生物利用度差，非常不稳定，这是由于其水溶性差，以及肠上皮细胞的代谢导致的。CsA实现口服递送的机制非常特别，除了环肽结构本身带来的天然优势之外，Me-Leu9和Me-Leu10两个相邻残基之间的酰胺键的构象在其中发挥了微妙但关键的作用（图1）[1]。这个结构特殊的肽骨架酰胺键的cis/trans构象平衡，在很大程度上取决于多肽分子所处环境的极性。在极性溶剂中，或者与受体亲环蛋白（cyclophilin）结合的情况下，trans构象占主导地位。但在非极性溶剂，或者晶体形态下，采取主导的则换成了cis构象。

       图1. CsA化学结构（红色酰胺键为Me-Leu9-Me-Leu10主链肽键）

       Kofron等人在他们的研究中发现，cis/trans相互转化动力学（能量壁垒为19 kcal/mol）与CsA和亲环蛋白的结合息息相关[2]。而CsA-亲环蛋白复合物的形成，反过来又对钙调神经磷酸酶产生影响。后者是一种Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，它是T淋巴细胞中的关键信号酶。由于CsA中这个酰胺键的cis/trans平衡取决于环境的亲水性，研究者因此提出假说，CsA会介导由cis到trans构象的转化，前者利于口服吸收，而后者利于与受体的结合。而这恰好满足了上述口服多肽药物的两个关键条件。

       CsA在其当前的口服制剂中（Sandimmune Neoral?）以脂质基础配方（这是由于CsA“过高”的亲脂性决定的），具有独特的微乳液给药方式，可实现60%生物利用度并具有相对较低的可变性[3]。CsA这种天然产物机制的复杂性是独一无二的，已成为研究多肽口服制剂生物利用度的主要模型。然而，微妙的构象转化很难复制在其它的合成多肽类似物中，从这个角度上看，CsA仍然像个曲高和寡的孤例，尽管令人高山仰止，但却很难复制它的高生物利用度机制。

       值得注意的是，2022年10月得到FDA批准上市的Voclosporin (商品名Lupkynis)是CsA的类似物，也是一款口服多肽，是用作治疗狼疮性肾炎的免疫抑制剂。拥有长达30小时的终末半衰期，人的口服生物利用度约为8%[4]。

       Voclosporin的化学结构实在与它的前辈cyclosporin太相似了，它只是用一个乙烯基替换了CsA 1位氨基酸残基侧链的甲基（图2中红色结构），而其它结构则完全相同。

       图2. Voclosporin化学结构

       三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽

       图3. 三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽化学结构

       Veber-Hirschmann肽c(PFwKTF)，是一种环化的生长抑素，对sst2和sst5生长抑素受体有选择性，其三N-甲基化类似物，三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽（图3）表现出了更高的生物利用度，可有效穿过Caco-2细胞单层。三-N-甲基化Veber-Hirschmann肽对血浆中的降解具有一定抵抗性，并且实现了10%的大鼠绝 对口服生物利用度[5]。显然，这三处溶剂化的酰胺键的N-甲基化增加了多肽的亲脂性。该多肽主链形成了两处βII’和βVI-转角二级结构，以及一个以cis-构象为主导的肽键。而这三处修饰依然保持了未甲基化的，具有生物活性Veber-Hirschmann肽的空间构型[6]。

       去氨加压素

       Ferring Pharmaceuticals的去氨加压素Desmopressin是激素肽加压素vasopressin的肽类似物（图4），它比加压素更能抵抗酶降解。其产品DDAVP?以口服剂的形式得到批准上市，用于尿崩症（diabetes insipindus）的治疗。Nocdurna?（仍然是desmopressin）又以舌下片剂的剂型获得批准，用于夜尿症的治疗。不良反应鲜有报道，甚至已经对儿童进行了夜间遗尿治疗。

       图4. Desmopressin化学结构

       从化学结构来看，去氨加压素是一种由二硫键连接的亲水性环状肽，具有广泛的氢键潜力。口服的去氨加压素通过细胞旁转运机制被吸收到血流中，口服生物利用度差（0.08-1%）[7]。尽管如此，去氨加压素较高的靶标亲和力实现了低剂量的给药[8]。由于去氨加压素的强大药效和较高的亲水性，去氨加压素和a-鹅膏菌素给人们这样的启发：如果多肽药物的活性和选择性足够高，在稳定性的保障下，即便很低的口服生物利用度，也有可能成为口服制剂的选择。

       ZYOG1

       图5. ZYOG1化学结构

       ZYOG1（图5）是一种可口服的线性肽，含有多个非天然氨基酸和三个Cα-甲基化氨基酸。ZYOG1类似于其他GLP-1激动剂，例如艾塞那肽，是一种源自exendin-4的化合物，并被开发用于治疗糖尿病。N端Val被嵌合到这些线性多肽前体中，以改善它们的生物利用度。尽管ZYOG1的口服生物利用度相对较低，但据称ZYOG1具有与皮下注射的艾塞那肽相当的良好口服功效（尚未公布绝 对值）。ZYOG1目前处于临床试验阶段，需要进一步开发以提高其生物利用度，并最终证明这种线性肽是否可以作为口服GLP-1激动剂用于治疗糖尿病。

       Griselimycin衍生物

       图6. Griselimycin衍生物化学结构

       链霉菌衍生的griselimycin衍生物，通过抑制DNA聚合酶对结核分枝杆菌产生高度活性，由此可以充当抗菌剂的角色。通过掺入非天然亲脂性氨基酸残基，进一步提高了其depsipeptide母肽(F = 48%) 实现非常高的口服生物利用度。环己基取代Pro的griselimycin衍生物（R=Cychexyl, 图6），显示出了F=89%的高口服生物利用度，以及提高的生物活性。与其他口服活性肽相比，三种griselimycin衍生物（图6）都具有极高的生物利用度。整体亲脂性的增加，导致了更高的结合亲和力和更高的生物利用度（griselimycin衍生物是由全疏水性氨基酸组成的环肽）。

       Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla)和Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla)

       图7. Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （左）和 Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （右）化学结构

       常见的口服多肽似乎比较钟情于六元环肽[9]，这种特征激发了人们把六元直线肽环化的热情。最简单直接的是全Ala环六肽，尽管这样的多肽毫无生物活性，但它却为六元环肽的空间结构研究提供了骨架，可以进行比如N-甲基化的化学修饰，以探索这些化学修饰可能对多肽空间结构带来的影响，以进一步探求这些结构变化带给多肽分子生物学的新特征。

       在多肽生物活性领域享有盛誉的RGD三肽结构（被多种integrin受体识别）在这种大背景下，被整合到各种六元环肽中，以实现包括消化道通透性提升在内的一系列目标。但亲水性氨基酸的存在削弱了多肽分子的肠道通透性，因此研究人员采用了所谓的LPCM（lipophilic prodrug charge masking，亲脂性前药电荷掩蔽）策略，以对应高极性给这些RGD环肽带来的不利影响[10]。LPC使得原本低细胞旁吸收的亲水性母肽（clog P= -3.3），摇身变成了通过跨细胞途径进入血液循环的多肽前药（clog p=6.6），因此实现了Cyclo(N-Me-D-Val-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) 肽（图7）44%的口服生物利用度[11]。Cyclo(N-Me-D-Ala-Arg(Hoc)2-Gly-Asp(OMe)-Ala-N-MeAla) （图7）在经过口服给药后，被血清酯酶切割成其生物活性形式，成为了integrin αvβ3高活性和高选择性的配体。这个生物活性配体可以增强 VEGF介导的血管新生，因此可以结合化学疗法治疗癌症[12]。

       MyR-c(MyD 4-4)

       图8. MyR-c(MyD 4-4)化学结构

       环肽c(MyD 4-4) （图8）对于细胞质衔接蛋白MyD88的抑制作用，被开发于自身免疫性疾病的治疗[13]。据报道c(MyD 4-4)多肽会破坏MyD88的二聚化和阻断人和小鼠巨噬细胞TLR2和TLR4的刺激。为了克服c(MyD 4-4)低口服生物利用度的缺陷(F=0.84±0.25%)，研究人员在一个仲胺结构上偶合了肉豆蔻酰基（MyR），衍生出了MyR-c(MyD 4-4)多肽[14]。改性后的多肽拥有大幅度提高的口服生物利用度（F = 47.6±16.2%），同时增强了抑制剂的生物活性。研究人员将亲水性的多肽c(MyD 4-4)在改性后口服生物利用度的大幅提高，归功于亲脂性的豆蔻酰基团的引入改变了多肽的空间结构，从而破坏了带正电的精氨酸与带负电的天门冬氨酸之间的盐桥。MyR-c(MyD 4-4)的口服活性，得到了EAE的体内疗效支持，这是一个多发性硬化症的小鼠模型[14]。

       Endomorphin-1（内啡肽-1）类似物

       图9. 内啡肽-1类似物化学结构

       线性阿 片肽内啡肽-1由四个天然氨基酸组成，显然容易产生快速酶促降解，生物利用度差，持续时间短。口服给药途径在这些数据面前，看起来有些天方夜谭。然而糖基化令内啡肽-1的生物利用度大大提高，为口服递送打开了一扇大门[15]。

       经过乳糖和琥珀酸手臂修饰的内啡肽-1类似物（图9），收获了膜通透性700倍的增长和长达2小时的作用时间。但葡萄糖琥珀酸单元显著降低了配体多肽结合μ-阿 片受体 (MOR) 的亲和力，尽管在MOR的结合亲和力和激动剂活性等表现上，endomorphin-1类似物受到修饰后呈现出不利影响，但它仍然显示出纳摩尔级的结合亲和力，相对于生物利用度上的优势，生物活性方面的表现已经足够令人满意。它在经过大鼠口服后产生剂量依赖性的疼痛缓解。这个例子表明，在某些情况下糖基化有助于提高多肽的生物利用度，同时保留可以接受的受体结合亲和力。糖基的选择与糖基化的修饰位点，对于多肽口服制剂的开发影响明显。

       司美格鲁肽

       图10. Semaglutide化学结构

       脂化修饰为多肽口服制剂打开了一扇广阔的大门。诺和诺德的2型糖尿病口服多肽制剂Semaglutide（Rybelsus?）的成功 (2019年被FDA批准上市) ，极大激发了从业者开发口服多肽制剂的热情，而它的成功经验之一正是对GLP-1类似物进行脂肪修饰（图10）。

       Semaglutide在口服给药后，能够保持很长的半衰期（约153-160小时，而注射后为 168小时）。但口服递送的方式显著降低了它的生物利用度，因此需要更高的每日剂量。未来用于多肽口服药的脂化试剂，可能会寻求比semegluitde (18碳) 更短的脂肪酸（例如12碳），这可能会增加生物利用度。