小脑（cerebellum, CB）对于运动行为的调节至关重要，还与语言、空间处理、工作记忆、执行功能和情绪处理等人类认知功能息息相关，因此在脑科学领域收到了广泛的关注。

       在所有的哺乳动物中，小脑起源于菱脑原节1号区域（rhombomere 1, r1），r1区域又包含了脑室区（ventricular zone, VZ）和菱唇（rhomboid lip, RL）。脑室区可生成γ-氨基丁酸能神经元（GABAergic neuron，一类释放γ-氨基丁酸的神经元），如浦肯野细胞（Purkinje cell）；而菱唇负责生成谷氨酸能神经元（Glutamatergic neurons，一类释放谷氨酸的神经元），如颗粒细胞（granule cell）。

       尽管小脑发育的早期阶段在不同物种之间具有保守性，但与其他哺乳动物相比，人类小脑具有神经元亚型比例改变和小叶复杂性增加这两大主要特征，并且菱唇中存在一些人类特有的神经祖细胞。菱唇的发育异常与多种小脑疾病相关，比如Dandy-Walker畸形、小脑蚓部发育不良和髓母细胞瘤（medulloblastoma）等。而其他小脑疾病，像自闭症和共济失调(Ataxia)，与浦肯野细胞的退化有关。

       上述这些疾病主要在小鼠模型中进行研究，但小鼠模型无法完全体现人类小脑细胞多样性以及功能特征，也无法完全重现人类疾病的各种表型。比如，在共济失调毛细血管扩张症患者中观察到浦肯野细胞缺失，这一表型无法在小鼠模型中体现。因此，脑科学家们迫切需要开发一种可以产生功能性浦肯野细胞的人源小脑细胞体外培养系统。

       美国加州大学Keck医学院Giorgia Quadrato团队开发了一种人类小脑类器官（hCerO），可以让包含浦肯野细胞在内的功能性小脑细胞，在体外人源三维环境中长期健康存活和成熟。相关成果以“Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells”为题，2024年1月4日发表在Cell Stem Cell杂志上。

       研究团队基于诱导性多功能干细胞（iPSC）产生hCero类器官。本文展示的培养方案，可以在类器官中形成人类小脑发育期间的主要细胞类型，包含胎儿菱唇中的特定祖细胞亚群以及浦肯野细胞。该培养方案具有很好的重复性，可以用于研究小脑发育与疾病中的细胞类型相关的特定分子机制。此外，hCerO类器官还显示有组织的层状结构，很像小脑发育阶段的颗粒层（granule layer, EGL）和浦肯野细胞层（Purkinje cell layer， PCL）。

       hCerO培养示意图

       DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013

       培养仅2个月的hCero类器官，可以形成神经功能网络。长期培养可以增加hCerO中兴奋性和抑制性神经元之间的功能连接水平。这些研究数据，为使用hCerO模拟与小脑微循环发育功能障碍相关的功能损伤奠定了良好的基础。

       hCerO的钙信号成像

       DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013

       通过空间转录组学手段，基于PCP2、DAB1、RORA和FOXP2等经典标志物，研究人员在培养6个月的hCerO类器官的外周发现了浦肯野细胞。此外，利用钙成像、膜片钳和钙结合蛋白染色等手段，发现hCerO类器官中的浦肯野细胞具有显著的树状末梢和不同的细胞形态。这是首次在体外全人源细胞培养系统中，成功培养出具有功能性的浦肯野细胞。

       hCerO的空间转录组学研究

       DOI: 10.1016/j.stem.2023.11.013

       展望与不足

       本文通讯作者Giorgia Quadrato

       （https://quadratolab.usc.edu/people/）

       本文解决了脑科学领域的一个重大技术难题，hCerO小脑类器官有望用于研究人类小脑发育、稳态和疾病过程中的细胞-细胞相互作用。本文为进一步认识小脑进化生物学，研究与菱唇发育相关疾病，重现小脑与其他脑区的连接，加速脑病相关药物研发，提供了一种有效的研究工具。

       但本文有以下三个的不足：

       （1）用于深入分析的细胞系数量较少

       在构建hCerO类器官时，使用了多种人多功能干细胞（hPSC）的细胞系，但在分析类器官的细胞多样性和区域特征时，只选择了其中一种细胞系。研究团队无法明确，不同的细胞系是否会产生不同的类器官细胞组成，或者不同的细胞系是否会导致不同的结论。所以，未来有必要纳入更多的人多功能干细胞系用于分析，以此来提供培养方案的有效性。

       （2）类器官培养时长不够

       研究人员只在培养了6个月的hCerO中对浦肯野细胞进行了功能分析，有必要在更长的发育周期内，研究浦肯野细胞的功能和形态发育。

       （3）缺少细胞迁移实验

       未来需要增加活体成像实验，来观察hCerO中的细胞迁移行为。这可以更好地研究颗粒细胞在类器官边缘的切向（tangential）移动或者层状结构（laminar layering）的短暂形成。