环状RNA崛起，mRNA 2.0或成下一个风口？

       在COVID-19疫情背景下，mRNA疫苗的快速崛起让RNA疗法成为全球关注的焦点。基于RNA的疫苗创下了历史上最快疫苗研发时间的记录，从开发到获FDA上市仅仅用时一年时间。发现了核苷碱基修饰的科学家更是凭此获得了2023年诺贝尔奖。 

       然而，mRNA疫苗在持久性和免疫原性等方面展现出的局限性，促使科学界积极寻求新的突破。正是这样的背景下，被誉为“mRNA 2.0”的环状RNA（circRNA）以其独特的优势被关注到。先进国际期刊Nature发文称“circRNA是RNA疗法的下一代重磅技术”。

       1976年，circRNA首次被发现，但当时被认为是细胞内mRNA剪接错误带来的副产物。2013年，Nature期刊同期发表了两篇研究论文，确立了circRNA是一类具有调控作用的非编码RNA，可以通过作为miRNA的海绵来调控其他基因表达。这让沉寂30多年的circRNA一鸣惊人，并陆续被发现在细胞分化、组织稳态、疾病发展，以及免疫代谢中发挥重要调节作用。 

       2018年7月，是circRNA发展史上的一个关键转折点，麻省理工学院（MIT）的 Daniel Anderson 等人在 Nature Communications 期刊发表论文，首次证实工程化的circRNA可在真核细胞中稳定、高效表达蛋白，开创了外源circRNA在真核细胞中表达蛋白的新应用，也证明了circRNA是线性mRNA的有效替代品。

▲ circRNA研究的里程碑事件

       线性mRNA疫苗虽然研发周期短且易于实现量产，但在RNA技术中有一个关键的缺陷，即其通常以线性形式存在，而这种形式存在的mRNA寿命很短。一般来说，在几个小时之内，细胞内的核酸酶就会将其降解掉。对于mRNA疫苗而言，其短暂的寿命并非什么大问题，因为RNA只需要很短的时间就能编码出蛋白质，从而引起免疫反应。

       而对于大多数治疗来说，则需要让RNA停留足够长的时间才能具有更长的疗效。这时候就需要在合成时对其进行大量修饰，以抵抗细胞内核酸酶的降解及避免引起先天免疫刺激，然后再通过脂质纳米颗粒（LNP）递送。整个过程效率低下，且价格昂贵。即便如此，修饰后的线性mRNA的半衰期还是较短。

       不同于线性mRNA，circRNA是一种独特的单链RNA分子，其最显著的特点在于其共价闭合的连续环形结构，原本在线性RNA分子中存在的3'和5'末端被巧妙地连接在一起，这与传统线性RNA截然不同。这一独特的环形结构赋予了circRNA诸多优势，不仅使其能够有效抵御核酸酶的降解，还显著提升了蛋白表达效率。同时，未修饰的circRNA具有较小的副作用，安全性能更高，且可以延长抗原递呈时间并保持长久的免疫反应，即使在低剂量水平，也可以增加其治病潜力，从而制造成本也大大降低。

▲ circRNA的形成

       递送策略上，circRNA的递送通常采用LNP、外泌体和病毒样颗粒。总体而言，目前circRNA的递送仍然广泛采用LNP系统。但LNP也存在一些不容忽视的缺点，比如具有肝脏积累的倾向，肝外应用受限等。外泌体和病毒样颗粒则具有更强的生物兼容性。

       （关于外泌体如何赋能下一代CGT药物开发，亦诺微创始人兼CEO周国瑛博士将于2024 年 9 月 4 日，在艾本德联合医麦客、ATLATL飞镖创新研发中心举办的以“逐本未来，品质为先”为主题的沙龙活动--新一代 CGT 药物创享交流会上分享。欢迎扫码报名线上或线下参加。）

       circRNA作为下一代RNA疗法的核心，有望治疗各种难治性疾病，包括病毒性传染病、肿瘤、病原菌感染、自身免疫性疾病、代谢性疾病等。

▲ circRNA的潜在应用

       蛋白质替代疗法：其目的是恢复那些缺失或有缺陷的蛋白质功能，通常是由基因突变导致。采用mRNA治疗内源蛋白缺失已应用于多种疾病。相对于mRNA，circRNA结构具有更高的稳定性，蛋白质表达时间更长，从而可以产生较高的蛋白质累积并持续较长时间，减少给药频率，且免疫原性较低。

       杜氏肌营养不良症（DMD），是由于 X 染色体上编码抗肌萎缩蛋白的基因突变所导致的遗传病，患者无法产生足够的抗肌萎缩蛋白。Orna Therapeutics公司发现了使用circRNA-LNP进行DMD的治疗，可以实现持久高效的蛋白表达，甚至是长编码区蛋白的表达，且编码全长抗肌萎缩蛋白和截短体的circRNA均能在原代骨骼肌细胞中表达。

       疫苗：疫苗接种的目标是诱导强烈的适应性免疫反应和长期免疫记忆。适应性免疫记忆的诱导部分取决于抗原暴露的持续时间。与mRNA相比，circRNA固有的稳定性延长了蛋白质翻译的时间，增加了体内的蛋白质产量，长期表达抗原可以更有效地诱导具有持久免疫记忆的免疫反应。

       近日，复旦大学基础医学院璩良等人发表了一篇文章，详细解析了通过注射编码HER2特异性肿瘤抗原的circRNA疫苗增强circRNA-CAR介导的巨噬细胞和T淋巴细胞的抗肿瘤效应。

       癌症免疫疗法：采用机体免疫的作用成分如细胞因子、抗体和免疫细胞等进行癌症的治疗。circRNA在癌症免疫治疗领域展现出多重优势，包括其可用于肿瘤个性化治疗、高稳定性确保抗原蛋白的稳定表达，以及诱导更强的免疫反应。同时，circRNA固有的较低免疫原性对于肿瘤内免疫刺激蛋白表达更具优势。

       细胞因子作为一类小型蛋白信号分子，已被证实具有增强抗肿瘤效果的能力。其中，白细胞介素-12（IL-12），作为细胞介导免疫的有效诱导剂，具有刺激活化 T 细胞和 NKT 细胞的效应功能，在肺癌等实体瘤中显示出良好的抗肿瘤作用。但由于它的脱靶毒性和给药方式的低效性，其应用受到限制。近日，多伦多大学李博文团队筛选出针对肺癌的H1L1A1B3 可电离脂质，将其整合进脂质纳米颗粒（LNPs）。然后利用这些纳米颗粒包封核酸，但包封的是 IL-12 circRNA，而不是IL-12 mRNA。将IL-12 circRNA 有效递送到肺部肿瘤，并联合免疫检查点抑制剂治疗（ICI），最终提高了肺癌免疫治疗的效果。

       基因编辑：与mRNA相比，circRNA提供的稳定性和稳健表达可以使Cas9蛋白的持久性更长，增加的蛋白表达可能会显著提高基因编辑效率。

       在ADARs介导的RNA编辑中，2022年，魏文胜课题组设计并运用了可招募ADAR的环形RNA（circ-arRNA），通过AAV递送，遗传编码的circ-arRNA可以在人的原代细胞和类器官中实现长时程的RNA编辑，这种可避免核酸外切酶切割的环状RNA进一步提升了体外和体内编辑的效率和精准性， 基本清除了双链RNA区域内目标转录本上的脱靶。

       非编码环状RNA治疗：circRNA在细胞内具有内源性非编码功能，如miRNA和RNA结合蛋白海绵功能。circRNA作为调控RNA，具有作为miRNA和RNA结合蛋白的竞争性抑制剂从而进行治疗的潜力。

       总的来说，circRNA 的潜力和市场的热情预示着其光明的前景，但其仍存在一些挑战。比如如何精准调控circRNA的表达水平，使其维持在适当的功能水平而不会过量表达导致毒性，还需要进一步开发；对 circRNA 修饰需要进行更深入的研究来进一步降低circRNA的免疫原性。同时，递送也是各应用的主要挑战之一。相信随着科研技术的不断进步，circRNA技术的持续改进有助于其更广泛的进入产业化阶段。

       放眼全球，尽管这个赛道吸引了国内外企业纷纷布局，然而目前还未有真正的circRNA药物上市，所有在研管线都处于临床阶段，已入局的玩家几乎都是刚起步创业的生物医药公司。

       同样，这个风口也被MNC盯上，布局该领域的新锐公司都从融资市场揽获了不小的支持。业内人士戏称，2021年堪称circRNA相关企业的融资元年。

       Orna Therapeutics是全球首家利用circRNA技术开发新疗法的公司，主要项目是一种原位CAR疗法，它结合了circRNA分子和LNP技术，将CAR直接递送至患者体内的免疫细胞。据Orna Therapeutics官网所示，其主攻方向是利用circRNA的稳定性制备原位CAR-T。

       另外，值得一提的是，Orna Therapeutics在人类细胞中实现了全长抗肌萎缩蛋白编码RNA的非病毒递送，以及在小鼠模型中实现了较小长度抗肌萎缩蛋白编码RNA的体内递送。

       Orna Therapeutics成立于2019年，成立之初便获得了1000万美元种子轮资金，2021年完成了1亿美元的融资，截至2022年完成了2.21亿美元的B轮融资，并与默沙东达成了一项总资金为36.5亿美元的合作。

       著名风投机构Flagship于2021年投资5000万美元创立了Laronde。Laronde同样布局circRNA赛道，其核心技术是自主研发的eRNA环化技术。成立仅3个月，Laronde就获得了4.4亿美元的B轮融资，是迄今为止circRNA公司获得的最大的一笔融资。

       2023年，Laronde宣布和Flagship孵化的一家纳米载体Senda Biosciences合并成为一家新公司——Sail Biomedicines，将Laronde的环状RNA平台和Senda的可编程纳米颗粒平台结合起来，开启全面可编程的药物开发。

       不仅是国际上布局circRNA的企业在疯狂吸金，国内不少企业也获得了大笔融资。以圆因生物为代表的circRNA新锐企业，与国际企业齐头并进，纷纷打造了各自的技术平台。

       圆因生物是国内首家布局circRNA的企业，建立了体外高效制备高纯度circRNA的技术平台，针对新冠病毒及其变异株，设计了编码新冠病毒刺突蛋白RBD的circRNA疫苗。2021年和2022年，圆因生物分别完成了超亿元的Pre-A轮融资和2.8亿元人民币的A轮融资。

       除此之外，2021年成立的环码生物也受到了资本的青睐，成为国内首家circRNA融资企业。截至目前，环码生物已经完成了A轮融资，预估累计融资金额近4千万美元。

       环码生物拥有多项自主研发专利，如基于II型内含子自剪接核酶的活性可在体外环化任意RNA，其还建立了一套基于circRNA的高通量筛选系统可以高效筛选翻译起始元件，并为circRNA建立了基于人工智能的序列优化设计平台。

       据悉，环码生物曾接连两度与MNC携手。2023年7月，环码生物与辉瑞就circRNA疗法达成研发合作协议。今年2月，环码生物宣布与BMS达成一项可行性研究合作。

       此外，国内企业先博生物和国外circRNA领头羊Orna Therapeutics还达成了合作。除了上述几家企业之外，其他代表性的企业还有科锐迈德、博雅辑因、吉赛生物、博安生物等也已经形成了具有独特优势的技术平台。

       在此背景之下，还有部分企业着眼于解决痛点、难点问题的核心专利技术上，如日前，艾博生物公布其自主研发的、拥有全球自主知识产权的高效RNA成环顺式剪接系统（Cis系统），突破了海外PIE系统专利的限制，有望成为高效制备高质量circRNA的突破性技术。放眼未来，本土创新想要避免发生“mRNA专利战”的前车之鉴，只有提早突破海外壁垒，才能有望在circRNA技术得到大规模应用之前，迅速抢占其带来的无限潜力和广阔的全球市场机遇。