随着生物学的发展，越来越多的野生新菌株被发现与应用。随着基因工程和代谢工程等合成生物学技术的发展，重组菌的构建和开发越来越高效，重组菌的应用也越来越广泛，更是有成为工业生物技术的主导趋势。
基因工程是指将确定性能的外源基因与特定载体在体外重组，然后转入目标菌株，使其表达出新产物或新性状。代谢工程是利用基因工程技术或其他物理化学方法对菌株的代谢途径、通量进行扩展或增强、阻断或减小，甚至构建新代谢途径的改造，从而提高目标产物的产量与效率，或合成新的代谢产物。重组菌分为两种类型，一种是不含外源载体，基因组直接携带外源基因，这种表达一般相对稳定，但因为其产生的遗传系统容易在重复DNA序列中触发同源重组而失效导致不稳定，且这种方式导入的外源基因拷贝数少。另一种是含有外源载体（通常是质粒载体），具有很高的拷贝数所以目的基因可以通过载体携带实现高表达，但同时会产生质粒稳定性问题。所以重组菌的稳定性是菌株改造与工业放大过程中需要直面的问题。
重组菌的不稳定性又分为结构不稳定性和质粒分离不稳定性。基因组重复序列之间、质粒载体位点之间的同源重组，宿主染色体及质粒载体上IS因子和转座子等转座元件的插入作用、邻位缺失或DNA重排，都有可能使基因组外源基因及质粒载体产生自发突变，从而导致结构不稳定性。此外，受体细胞的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解，外源基因过量表达时能量和物质的匮乏以及表达产物的毒性作用诱导受体细胞产生应激反应，激活核酸酶和蛋白酶对重组DNA分子的降解，也都会导致结构不稳定性。消除结构不稳定性的可用策略就是选用重组缺陷菌株作为宿主菌。
王莹等(1)通过将布鲁菌的per基因敲除，同时将带有同源片段的打靶载体pMD19-T:kan电转化布鲁菌，利用体内同源重组的方法，将kan抗性基因通过per两侧同源序列置换染色体上的待缺失区域，获得布鲁菌per基因重组菌，该重组菌能够稳定传代培养至10代，Kan基因序列与per突变株第1代及第10代测序结果比对，同源性为100%，PCR产物电泳结果证明突变株培养1-10代均无回复突变。其结果证明，利用体内同源重组方法构建的布鲁菌per基因突变株具有较好的遗传稳定性。
质粒的分离不稳定性是指在细胞分裂过程中的质粒的随机分配，与带质粒少的下代细胞生长负担反而轻，导致质粒因传代丢失。质粒拷贝分配到子细胞中的途径可分为主动分配和随机分配两种方式。主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的适度稳定性。随机分配过程中质粒分离不稳定性取决于无质粒细胞的产生概率和细胞的比生长速率。
鲍张杰等(2)先分别构建重组质粒pETDuet-1-fdr-fdx及pACYCDuet-1-vdh，再将这两个相容性质粒同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌。采用IPTG对重组大肠杆菌进行诱导，使其表达目的蛋白，利用SDS-PAGE检测其蛋白大小及可溶性。采用液体传代的方法研究质粒稳定性，初步得到重组大肠杆菌传代培养30代，质粒稳定性高达99%，连续传代培养到50代，质粒稳定性92%。证明该重组大肠杆菌具有较好的稳定性。
郭晋霞等(3)利用毕赤酵母中的看家基因GAP（以单拷贝的形式存在）为内参，采用双标准曲线方法，提出了一种对重组毕赤酵母重组菌pPICZ-DT30/GS115（表达人胰岛素前体(PI-DT30)）中外源基因DT30拷贝数的快速、准确的荧光定量PCR检测方法。根据标准曲线和值计算外源基因DT30在毕赤酵母重组菌中的拷贝数为7个。外源基因拷贝数是监测目标蛋白表达量能力的一个重要指标，对毕赤酵母重组菌稳定性的考察有重要意义。
重组菌反应工程的前沿研究近年来也取得了些突破性的进展。如Du Fei(4)等开发了一种快速构建高性能重组菌的染色体多拷贝整合策略，首先利用非重复序列编码计算器得到非重复序列作为表达元件，在此基础上开发了对不同重组菌具有普适性的多拷贝整合方法；通过机器学习理性计算代谢途径基因的最佳拷贝数组合，构建了具有高遗传稳定性的解脂EPA（二十碳五烯酸）重组菌以及大肠杆菌（番茄红素）重组菌。相关实验结果展示了该策略在工业微生物中的广泛适用性以及潜在应用价值。
综上，影响重组菌稳定性的因素可以归结为重组策略及宿主菌因素与质粒自身因素。重组菌的稳定性也关乎工艺研究的放大过程。培养过程中的比生长速率及外部环境，包括生长发酵时的培养条件，对重组菌的稳定性有影响，还有细胞内外源产物的积累也会对其稳定性有一定影响。这一块的理解及应对策略有待下回分解。
参考文献：
1. 王莹, 安潇潇, 王健, 王芃, 黄芳, 周建光, et al. per基因突变对布鲁菌稳定性的影响. 生物技术通讯. 2016;27(2):204-7.
2. 鲍张杰, 陈向东, 汪辉, 任聪, 练家惠. 具有羟基化酶体系活性的重组大肠杆菌的构建. 药物生物技术. 2019(2):95-9.
3. 郭晋霞, 何云凤, 范开. 荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母工程菌的外源基因拷贝数. 重庆理工大学学报：自然科学版. 2016;30(2):77-83.
4. Du F, Li Z, Li X, Zhang D, Zhang F, Zhang Z, et al. Optimizing multicopy chromosomal integration for stable high-performing strains. Nature Chemical Biology. 2024.
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