CHO细胞系开发在重组蛋白生产中的最新进展

摘要：

在生物医药研究、诊断和不同疗法中使用的重组蛋白大多是在制药工业中的中国仓鼠卵巢细胞中生产的。这些生物治疗药物，特别是单克隆抗体，在过去几十年中显示出显著的市场增长。对大量生物制剂日益增长的需求要求不断优化和改进生产技术。研究旨在发现更好的手段和方法以达到更高的体积容量，同时保持稳定的产品质量。越来越多的复杂新型蛋白治疗药物，如病毒抗原、疫苗、双特异性和三特异性单克隆抗体，目前正进入工业生产管线。这些生物分子在许多情况下难以表达，需要针对产品特定的解决方案来改善它们的瞬时或稳定生产。所有这些要求推动了更高效表达优化系统和高通量筛选平台的发展，以促进产品特定的细胞系工程和生产策略的设计。在这篇简评中，我们提供了关于CHO细胞系开发、靶向基因操作技术、选择系统和目前在重组蛋白生产中使用的筛选方法的最新进展的概述。

1.介绍

生物治疗药物和诊断（治疗诊断学）是制药市场中迅速增长的产品。它们包括各种单克隆抗体（mAbs）、疫苗、激素和其他蛋白质，所有这些都有广泛的应用。自2002年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了300多种生物制药，并且这一数字还在增长，因为生物制剂（蛋白质、核酸、糖及其复合物）正在进入诊断和治疗的越来越多的领域。满足这些产品日益增长的需求仍然是一个挑战，并推动了制造过程中的不断创新。策略旨在优化蛋白质表达，以实现更高的体积生产率，同时保持稳定的产品质量和较低的制造成本，并缩短时间。可用的生物制剂中很大一部分是重组蛋白，其中大多数是在哺乳动物表达平台中生产的。在这篇综述中，我们专注于这个表达系统，尽管还有其他系统可用于生产活性重组蛋白，并正在评估其在制药工业中的潜在应用。哺乳动物细胞倾向于成为工业生物制药生产的主导宿主，主要是因为它们能够产生多样化、正确折叠和糖基化的蛋白质。在过去十年中，翻译后修饰的重要性，特别是糖基化，以及它们如何影响重组蛋白的不同属性的问题，引起了广泛关注。广泛的研究导致发现，为了潜在的治疗用途，大型和复杂的蛋白质需要具有类似人类的翻译后修饰，才能具有功能性和非免疫原性。不同小组的几项研究表明，适当的糖基化轮廓促进生物活性和稳定性，增加半衰期并减少蛋白质治疗药物的免疫原性。

2.用于制药重组蛋白表达的CHO表达平台

基于哺乳动物表达的系统涉及各种不同来源的细胞系，包括仓鼠（CHO, BHK）、人类（HEK293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7）和小鼠（NS0, Sp2/0）。然而，70%的生物制剂，几乎所有的单克隆抗体，都是在仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的，作为生物制药蛋白生产的最常用和首选宿主。它们的流行在于它们能够高生产率（批培养中0.1–1 g/L，在补料批培养中1–10 g/L），表现出一致的良好生长表型，适合大规模工业培养，可以轻松适应各种化学定义的培养基，对人类病毒的感染不太敏感，并且能够进行与人类兼容的糖基化。CHO ori细胞系是由Theodore Puck在1956年分离和永生化的。然后通过引入突变或适应不同的培养条件进一步开发亚克隆。与亲本细胞系相比，CHO ori衍生的细胞系具有特定的属性，更有利于高效蛋白质生产或生产者细胞系的建立。CHO DXB11 (dhfr+/), CHO DG44 (dhfr/) 和 CHO-GS-/- (CHO-K1SV)宿主已经生成，通过利用代谢标记，即二氢叶酸还原酶介导的甲氨蝶呤（MTX）基础和谷氨酰胺合成酶介导的甲硫氨酸亚砜胺（MSX）基础选择系统，使克隆选择更容易和更快。同时，MTX选择也作为一种基因扩增系统，允许高产品产量。CHO-S及其衍生细胞系已经适应悬浮培养，目的是通过增加生产者细胞密度来实现更高的体积生产。尽管共享相同的共同祖先，不同的CHO谱系由于广泛的诱变和克隆选择表现出显著的遗传异质性。这些遗传差异，也影响核型和表观遗传变异，解释了最广泛使用的CHO细胞系（主要是CHO-K1, CHO DXB11, CHO-S和CHO DG44）之间的宿主细胞特异性差异。因此，CHO表达平台为宿主细胞选择和蛋白质生产优化提供了广泛的选择。不同小组的比较研究提供了大量关于不同重组CHO细胞系对各种生物制剂的细胞特异性生长和产品形成的数据。在一个代表性例子中，Reinhart等人已经表明，CHO-K1细胞更倾向于细胞特异性生产力（7–16 pg/cell/day），而CHO-S更倾向于生物质生产，但单克隆抗体表达较低（2–6 pg/cell/day），这与CHO DG44细胞相似（在相同的实验设置中为2–4 pg/cell/day）。该小组还研究了CHO宿主对不同培养条件（批培养、补料批培养、半连续灌注培养）和化学定义培养基的偏好。研究得出结论，观察到的表达差异与宿主细胞特异性表型和代谢有关，并与培养方法或细胞培养培养基没有很强的相关性。

3.CHO细胞系优化——历史视角

数十年来，世界各地的研究团队都投入了巨大努力，试图提高生产者CHO细胞系的性能。这些细胞系操作的尝试旨在实现更高的生产力和产品产量，并利用了关于转录、翻译、细胞代谢、信号通路和分泌机制的现有知识。宿主细胞工程的主要策略是基于过表达有利于细胞增殖、长寿、应激和凋亡抵抗、蛋白质生产和分泌的基因。众多研究表明，瞬时或稳定过表达参与细胞代谢、蛋白质生物合成和糖基化的关键基因可分别提高生长速率、生产力，并获得更好的产品质量。通过过表达各种转录因子、抗凋亡（例如BCL2、XIAP、AVEN、MCL1）和促增殖基因，也已证明细胞活力和培养性能得到改善。蛋白质组学的进步也为宿主细胞的合理工程做出了贡献。蛋白质组学数据的分析被用来识别基因操作的潜在靶点，以提高产品产量，如谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚单位的报道。与有益基因的强制表达相反，其他细胞系优化方法侧重于通过基因组敲除或通过RNAi介导的基因沉默来消除或抑制“不利”基因。破坏基因功能或消除基因产物有不同方式：i）通过靶向基因组操作部分或完全删除特定基因，ii）通过突变“关闭”基因功能，iii）siRNA介导的基因沉默。微RNA（miRNA），已知在哺乳动物细胞的转录组调控中起着关键作用，在过去十年中也已深入研究其在CHO细胞工程中的潜力。越来越多的证据表明，miRNA对诸如转录、翻译、核糖体生物合成、分泌、细胞周期、代谢和细胞死亡等多个细胞功能有影响。因此，利用miRNA调控系统代表了一种高效分子工具，可用于整个细胞途径的工程。miRNA过表达（例如miR-2861、miR-23、miR-17）或通过抗miRNA、病毒载体、海绵和tough decoy载体（例如miR-7、miR-106b、miR-14等许多其他）敲低，已在CHO细胞系优化中成功使用，以使细胞适应应激环境、温度变化并增强蛋白质生产。最近一项研究报道了使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统删除miR-744，目的是提高CHO生物过程性能。操纵miRNA介导的调控也已应用于提高人工设计的难以表达的新生物治疗剂的生产。历史上，基因消减研究针对的是代谢（例如LDHA）、促凋亡（BAX、BAK）和抗增殖基因，以及细胞周期检查点激酶（ATR）。正如预期的那样，这些选定基因的消除或沉默导致培养性能改善、凋亡抵抗增强和产品产量提高。参与染色质重塑（例如HDACs）和糖基化（例如FUT8、SLC35C1）的基因也成为敲除研究的靶点，以更好地了解如何操纵细胞系以表达具有定制翻译后修饰谱的重组蛋白。所有这些宿主细胞工程的成就都被视为成功故事，因为它们导致了CHO宿主衍生物的产生，这些衍生物在生长、应激抵抗和生产力方面超过了它们的亲本细胞系。工程生产细胞系已被证明能够实现创纪录的高3–7 g/L体积生产力。然而，监测工业制造中生产效率的数据表明，在许多情况下，不可能从高滴度生产过程的生物反应器中回收全部产品。由于这个下游处理瓶颈，产品似乎并未从非常高滴度中受益，进一步提高滴度的努力可能带来收益递减。此外，在许多情况下，观察到重组细胞系在长期培养过程中活力和生产力下降，从而使工业界面临进一步挑战。

4.工业细胞系开发的新焦点领域

在2010年之前，许多生物制药公司遵循开发自己的生产细胞系的政策，但过去十年中这种方法发生了变化。现在公司倾向于使用相同的宿主细胞系进行生产和初期临床试验，因为他们意识到这种策略简化了细胞系开发周期，并优化了通往临床的道路。此外，它降低了产品可比性问题的风险，并帮助制造商满足产品质量要求和一致性预期。这些变化的优先事项促成了CHO表达平台创新的新方向。工业细胞系开发的焦点已转向宿主细胞系稳定性问题，以确保稳定的长期生产，使用靶向整合技术进行表达优化，特别是对于复杂的工程重组治疗剂，以及开发选择和筛选系统，以实现更快、更有效的克隆选择（图1）。

图1. 工业细胞系开发中创新研究的当前重点领域。

4.1.CHO细胞系不稳定性

在制药行业中使用的CHO细胞，以良好的适应遗传操作和改变培养条件的能力而著称。这一特点源于这些细胞系本身具有可塑性的基因组，这使得它们适合于大规模工业生产。然而，不利的是，这种细胞可塑性使得CHO细胞更容易发生基因组重排（缺失、易位），并在生物生产过程中成为细胞系不稳定的源头。生产细胞面临着高基因组和代谢需求，可能导致基因组和表观遗传变化，从而导致生产力和产品质量下降。尽管如此，CHO细胞系提供的众多优势使它们成为重组蛋白生产的理想宿主，因此，科学和工业界在近期内不太可能放弃这一表达系统。因此，最近已投入大量努力来理解CHO细胞系不稳定的这一现象。研究重点是寻找解决方案，以克服制造过程中表型不稳定的难题，确保长期稳定的生产、过程一致性，并确保产品质量可接受。与所有其他快速生长的永生化细胞一样，CHO宿主细胞系在基因组上不稳定且克隆内异质，这赋予了系统鲁棒性和灵活性，但导致生产稳定性问题。为了更好地理解CHO细胞的异质性，Borth及其团队在一系列实验中研究了在亚克隆和克隆选择用于生产细胞系生成过程中，异质性是如何传递的。他们发现，亚克隆本身并没有导致亚克隆与原始细胞池相比（无论是宿主细胞系还是重组细胞系）遗传和表型异质性的减少。相反，选择特定的细胞特性导致了核型同质性和染色体稳定性增加。Baik和Lee也研究了CHO细胞系不稳定性、核型变异和生产不稳定之间的联系。他们提出了一个生产不稳定的机制模型，其中随机的染色体重排与生长优势和非生产或低生产克隆相关。同时，针对特定表型/基因型的MTX选择降低了生长速率，但提高了产品产量。在稳定重组细胞系的开发过程中，一个重要的问题是生成和识别高产克隆，这些克隆不会随时间失去表达能力。（克隆性在治疗蛋白生产中被认为是关键的，因为克隆系被认为能提供稳定和一致的产品质量特性。）然后需要在长期培养中评估选定克隆的生产情况，这是一个劳动密集型且耗时的过程。然而，目前在CHO细胞系上迅速积累的转录组数据为功能分析开辟了道路，以识别高生产和克隆稳定性的调节因子和生物标志物。按照这种方法，Ritter及其同事分析了低产和高产CHO克隆的基因表达谱，以寻找细胞工程的潜在目标，使克隆选择更快、更有效。他们发现，大多数稳定的高产克隆都标记为染色体8的端粒区域缺失。建立的实验模型结果证实，与对照CHO-K1细胞相比，CHO-C8DEL细胞（染色体8的端粒区域缺失）表现出更高的体积生产率，并产生了更稳定的生产克隆。进一步地，该团队进行了一系列敲除和敲低研究，并在选定的端粒区域内确定了两个特定目标，Fam60A和C12orf35，它们在创造CHO-C8DEL细胞观察到的表型中起作用。据报道，这些基因的缺失或表达减少与更高的生产率和更快地从选择中恢复相关。

4.2.靶向基因组操作技术

在重组细胞系生成中，最密集的研究方向集中在使用靶向基因组整合技术进行表达优化。对于建立稳定和克隆（同源）生产者细胞系，转基因需要整合到宿主基因组中。传统方法依赖于表达载体的随机整合，随后从具有异质转基因插入的重组细胞池中耗时筛选合适的细胞。这种方法有两个主要缺点：整合效率低和整合位点的位置效应。为克服这些问题，人们做出了不同的尝试。借助不同的转座子系统（Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac、Tol2），成功提高了整合效率。据报道，使用转座子介导的基因整合仅在2-3周内生成的重组CHO池能够实现异常高的产品滴度（>7 g/L），因此可用于快速生产大量蛋白质。借助转座子系统的基因整合仍然是一个感兴趣领域，并正在评估其在生物医学研究不同领域的潜在用途。过去十年中，几个研究小组也解决了由于随机整合导致的“位置效应”问题。Neville等人综述的普遍染色质开放元件（UCOEs）以及其他在高生产细胞基因组中识别的调控基序已被应用于防止基因沉默并维持高水平表达。细菌人工染色体（BACs）也是一种流行且广泛使用的方法，用于确保整合转基因的位点独立、稳定和高水平表达（例如，在实验室规模的生物反应器中为选定抗体达到0.75 g/L，在摇瓶中达到1.12 g/L）。

靶向基因组操作技术使得重组蛋白编码基因能够敲入到定义良好且转录活跃的基因组位点中。与随机整合相比，这是一种建立生产克隆的更快且更高效的方法。靶向细胞基因组修饰得益于目标特异性基因编辑工具的出现，例如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）RNA引导的核酸酶。其中，CRISPR/Cas9系统因其易用性（与ZFNs和TALENs相比）、高编辑效率和低成本而成为受欢迎的选择。可编程核酸酶产生双链断裂，这些断裂在哺乳动物细胞中通过内源性DNA修复机制解决。这些机制包括不同的途径：i）非同源末端连接（NHEJ），ii）同源定向修复（HR）和iii）微同源介导的末端连接（MMEJ）。靶向基因组编辑工具的主要应用涉及在细胞或生物体的基因组中敲除或敲入感兴趣的基因。
近年来，人们投入了大量努力来识别宿主细胞基因组中的转录“热点”。靶位点的选择基于先前的经验数据、转录组数据分析或借助慢病毒筛选。不同研究小组最近使用的位点包括Fer1L4、Rosa26、Hprt、Hipp11、C12orf35和GS。如今，最先进的技术是整合不仅单个转基因，还有复杂的盒式结构，称为“着陆垫”，以生成主宿主细胞系。着陆垫包含选择标记和重组酶或整合酶的识别位点，允许精确插入任何种类和任何数量的表达盒到已建立的位点。有许多系统已有效用于在哺乳动物细胞中通过位点特异性重组介导表达盒交换，例如Cre-loxP、Flp-FRT、BxB1重组酶、PhiC31整合酶（见表1）。

最近的一项研究报道了多着陆垫DNA整合平台的开发，该平台在不同的基因组热点插入了3-4个着陆垫，用于先进的细胞工程。其他小组生成了替代版本，允许累积整合相同基因的多个拷贝或不同基因。然而，这种构建可能会带来重复介导的基因沉默问题（也影响多顺反子构建和彼此接近的基因），但有各种方法可用（例如使用表观遗传修饰元素，如绝缘子、UCOEs）来防止CHO细胞中转基因的沉默。上述讨论的平台已开发用于促进制药行业中重组生产细胞系的生成。它们也是表达优化新型复杂蛋白治疗药物的有价值且有前景的工具，并且可能应用于合成生物学。

4.3.关于产品质量和数量的难以表达的重组蛋白治疗药物的表达优化

目前，大量经过工程改造的复杂重组蛋白正在填充工业生产管线。尽管使用了先进的CHO细胞表达平台，这些蛋白在许多情况下被证明是“难以表达”的（DTE）。制药行业的一个主要创新研究领域集中在提高这些生物产品的可制造性。最近，不同研究小组进行了多次尝试，试图理解生产瓶颈的原因，并寻求这些问题的解决方案。

首先需要解决的关键问题是转录水平的表达优化，这涉及表达构建设计、基因组整合方法以及与整合位点的基因组环境的相互作用。即使在定义良好的整合位点，重组蛋白的转录水平也受到整合位点与表达盒组件之间相互作用的影响。对这一现象的研究对于可编程细胞工程至关重要，以便能够预测多个组件如何贡献于插入转基因的最终净表达。为解决这一问题，Kildegaard及其同事开发了一个分子工具箱，用于系统评估产品和位点特异性重组基因表达。

利用CRISPR/Cas9技术，他们构建了一系列具有针对着陆垫的靶向整合位点的CHO-S模型细胞系，其中重组基因在定义的50近端调控元件下。他们表明，不同的调控元件在定义的整合位点产生了强大的重组基因表达模式，具有广泛的转录输出。Cartwright及其同事报道了开发高通量微型平台用于多并行测试不同遗传组件，并系统评估它们对DTE蛋白生产的影响。该小组旨在优化细胞工程解决方案，用于模型DTE IgG的稳定和瞬时生产。他们得出结论，最佳方法是产品和遗传背景特异性的，并且稳定和瞬时生产之间存在显著差异。Tadauchi等人进行了一项系统调查，旨在了解是什么使得抗体表达困难。他们构建了具有定义基因组整合位点的着陆垫的模型细胞系，其中插入的转基因在（Tet/Dox）诱导型启动子的控制下。该系统使得能够表征可能具有毒性或因任何原因难以表达的蛋白的表达。其他工作集中在转录调控上，例如在miRNA介导（miR-557）的宿主细胞工程中，已被证明有助于增强DTE蛋白表达。

分泌缺陷是复杂治疗药物，特别是DTE单克隆抗体（如英夫利昔单抗）的另一个主要关注领域。针对这一问题，不同研究团队采用了多种方法。在最近的研究中，Hussein等人描述了一种新的蛋白质工程策略，以绕过分泌瓶颈，从而提高DTE蛋白的生产。该团队进行了逐步分析，以了解限制选定重组蛋白TIMP-3和TIMP-4生产的分子机制，并确定翻译后处理阻滞是蛋白表达的限制步骤。为克服这一限制，他们构建了一个融合蛋白，其中包含一个分泌生长因子的短前序列，该序列具有蛋白酶furin的天然切割位点。同时，在同一实验细胞系中过度表达furin。这种策略已成功用于提高原本分泌不佳的TIMP家族两个成员的蛋白生产。在该研究之后，应用计算工具分析TIMP-3编码核苷酸序列，以识别导致分泌不佳的序列特征。根据获得的数据，该团队构建了一个用于DTE重组靶标的蛋白质嵌合体设计模型。Otte及其团队报告了建立一种基于自动化共聚焦显微镜的方法，用于研究细胞内DTE蛋白表达，以探索生产瓶颈的原因。在代表性研究中，Mathias等人追踪了选定重组DTE蛋白在细胞合成过程中的处理，并调查了它们在分泌途径相应细胞器中的分布。他们发现，在选定抗体的情况下，错误折叠是限制速率的步骤，也是阻碍分泌的原因，因为它导致了分子的内质网相关降解。

除了体积生产率外，产品质量对于生物治疗蛋白生产也至关重要，并且一直是工业技术开发努力的焦点。糖蛋白是生物治疗药物中增长最快的类别。正确的翻译后修饰，特别是糖链结构，对于这些生物制剂的效力以及药代动力学和药效学特性的控制至关重要。此外，不仅糖基化（唾液酸化、岩藻糖化）的性质和数量重要，N-糖链的异质性也可能是一个问题。这种异质性，由于N-糖链处理的变异性而产生，可能会损害糖治疗药物的活性和安全性。Yang及其同事描述了如何通过遗传工程改造CHO细胞，以近乎均质的形式生产糖蛋白。他们对CHO糖基转移酶进行了敲除筛选，以识别控制N-连接糖基化关键步骤的关键基因，并表明CHO细胞能够耐受糖工程改造而不会发生补偿性变化。根据他们的结果，他们提供了一种在模型细胞系中重建更均质糖基化能力的策略。

4.4.高通量筛选和选择系统的最新进展

选择系统在几十年间已经标准化，然而，不同选择系统的优缺点仍然是一个争论的话题，特别是在MTX选择系统的情况下。几项研究表明，由MTX选择导致的基因扩增是重组细胞系生产不稳定性的一个主要原因。此外，多轮MTX选择需要更长的时间来生成细胞系。最近，Yeo等人也发表了一项大规模的比较研究，探讨不同类型的标记基因如何影响不同CHO细胞系的生产稳定性。他们的结果表明，需要针对不同类型的CHO细胞优化选择标记基因的表达，以提高对最佳生产者克隆的选择严格性。

随着市场对生物治疗产品需求的增长，时间和成本成为了制造过程中的重要因素。在过程设计和优化中，更多地关注如何减少新生物产品重组细胞系生成所需的时间和成本。这推动了高通量克隆筛选和表征的新方法和技术的发展。许多改进工作集中在单克隆上，因为这是生产者细胞系建立过程中最耗时的环节。现在已有几种新技术可用于更有效地分离单细胞，取代传统的“限制稀释”方法。现代克隆方法使用专门的仪器来确保单个细胞被播种到微量滴定板孔中。荧光激活细胞分选（FACS）已成功用于根据特定细胞属性（表明高生产性）对单细胞进行分选。Solentim开发的VIPS（原位验证板播种）以及Cytena单细胞打印机仪器结合了细胞播种与显微镜成像，以确保单细胞沉积，从而保证衍生克隆的单细胞起源。Berkeley Lights的Beacon平台利用微流体和光电子定位技术，通过软件控制操作，在单芯片上并行培养、操纵和表征数千个细胞。ClonePX FL提供了一种基于表达的方法，在半固体培养基上，用于高效高生产者克隆/菌落的选择和分离。

许多这些技术发展和现代仪器为高通量自动化过程提供了可能，已经在制药行业成功引入，并现在应用于工业重组蛋白生产。

4.5.“组学”技术——系统生物学方法

自2010年代以来，“组学”方法和“组学”技术的出现促进了对细胞特征和身份特征的深入理解，这些特征表明了最佳生产状态。在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和糖组学领域，现在有大量的数据（并且每天都在增加），这些数据提供了对特定时刻细胞状态和特征的系统级洞察。Stolfa等人发表了关于CHO的可用资源和数据库的全面总结。与此同时，生物信息学中计算方法和算法的不断发展使得这些“组学”数据能够被转化为与细胞机制和功能相关的生物学信息。这些信息与计算建模一起被用于CHO研究的所有领域：用于预测细胞行为，探索重组细胞系中不同生产效率背后的转录组水平克隆变异，或识别操纵生产者细胞系应激反应和敏感性的新靶点。在最近的一项研究中，Kol等人进行了多重分泌组分析，以研究宿主细胞蛋白对重组蛋白生产的影响。通过系统的计算机（计算筛选）和体外分析，Nguyen等人从CHO细胞中识别出内源性启动子和增强子元素，这些元素可用于转基因表达优化的潜在用途。Brown及其同事进行了基于转录组的分析，以识别用于qPCR数据标准化的最佳参考CHO基因。该研究结果已适应于制药行业常规用于生产者细胞系稳定性表征。随着“组学”技术的进步，糖基化谱的系统分析为CHO细胞的糖基化网络提供了新的见解，并有助于开发新的糖工程策略，旨在产生更有效的疗法，减少副作用——正如Tejwani等人在一篇全面的综述中总结的那样。Stach等人描述了一种将系统级动力学模型与合成生物学相结合的方法，以研究N-糖基化的本质，并测试遗传扰动对产生IgG的半乳糖化行为的协同作用。

5.未来展望

系统生物学方法为增强基于CHO的生物生产开辟了新的维度。“组学”技术提供了更好地表征和理解复杂细胞功能的新机会，从而为机制驱动的细胞系优化创造了基础，而不是操纵几个关键基因。然而，一个主要问题是这些现代技术需要特殊的仪器、材料和先进的信息技术设施，因此它们仍然过于复杂和昂贵，无法在工业制造中常规使用。另一方面，迄今为止不同“组学”技术提供的数据还无法整合到一个通用的数学模型中，这将有助于在实验过程设计中转移和应用这些信息。如何将这些知识适应并整合到关于重组蛋白生产的工业生物过程优化和开发中仍然是一个挑战，需要在未来解决。