贴壁细胞如何驯化为悬浮细胞？

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作者：帅帅来源：抗体圈

2025-02-13

文章阐述贴壁细胞向悬浮细胞驯化技术在生物制药领域的关键作用，介绍主要驯化方法、关键技术、面临挑战及应用前景，为规模化生产提供基础。

贴壁细胞向悬浮细胞的驯化是生物制药领域实现大规模工业化生产的关键技术之一。通过优化培养基成分、调整培养条件及采用特定驯化策略，可显著缩短驯化周期并提高细胞活率和稳定性。以下从驯化方法、关键技术、影响因素及挑战等方面进行系统阐述。

一、贴壁细胞驯化的必要性

贴壁细胞（如HEK293、CHO等）在传统培养中依赖血清和贴壁表面，但血清成本高、批次差异大，且贴壁工艺难以规模化。悬浮培养则具有无血清、成分明确、易放大等优势，适用于生物反应器生产病毒载体、单克隆抗体等生物制品。

二、主要驯化方法及步骤

1.梯度降血清结合悬浮驯化法

步骤：

● 初始复苏：使用含10%血清的培养基（如DMEM/F12）恢复细胞活性，传代至稳定。
● 逐步降血清：将细胞依次转移至含血清梯度（如5%、3%、2%、1%）的混合培养基中，每个梯度传代1-3次，同时引入摇瓶悬浮培养。
● 无血清适应：最终过渡至无血清培养基，通过半量换液法维持细胞密度（如3-10×10⁵ cells/ml）和代谢活性。
优势：驯化周期缩短至1个月内，细胞分散性好，活率高。

2.无血清快速驯化法

步骤：

● 单克隆筛选：通过有限稀释法筛选生长快、转染效率高的单克隆细胞。
● 肝素钠辅助驯化：在无血清培养基中添加肝素钠（终浓度100-300 U/mL），抑制细胞聚集，结合耐CO₂摇床培养（80 rpm，37℃）加速适应悬浮环境。
● 动态传代：每天或隔天传代，逐步降低肝素钠浓度，直至细胞完全适应无血清悬浮状态。

优势：周期仅需数周，适用于HEK293T等易结团细胞。

3.直接悬浮驯化法

● 步骤：将消化后的贴壁细胞直接接种至无血清培养基中，通过离心沉降、转瓶/摇瓶培养（转速110-140 rpm）及多次传代（5次以上）筛选悬浮细胞亚群。
● 关键调整：降低培养基中钙、镁离子浓度以减少聚集，添加抗结团剂（如Pluronic F-68）和泡沫抑制剂。

三、关键技术及优化策略

1.培养基优化

● 无血清培养基设计：需补充胰岛素、转铁蛋白、脂类等关键成分，替代血清功能。
● 添加剂应用：肝素钠、聚乙烯醇（PVA）等可改善细胞分散性；抗氧化剂（如谷胱甘肽）减少氧化应激。

2.培养条件调控

● 物理参数：摇床转速（80-140 rpm）、溶氧（30%-60%）、pH（6.8-7.2）需逐步优化以维持细胞代谢平衡。
● 温度与CO₂：通常为37℃、5% CO₂，但部分细胞需适应低CO₂环境以提高悬浮稳定性

3.细胞系选择与单克隆筛选

● 适用细胞类型：HEK293、CHO、BHK21等贴壁依赖性较弱的细胞更易驯化。
● 单克隆优势：筛选高生长速率、低结团率的克隆可提升驯化成功率。

四、挑战与解决方案

1.细胞结团问题

● 成因：细胞间黏附分子（如钙黏蛋白）过度表达或代谢废物积累。
● 对策：添加肝素钠、调整培养基离子浓度，或通过机械搅拌（如磁力搅拌子）物理分散。

2.驯化周期长

● 传统瓶颈：梯度降血清法需数月时间。
● 创新方案：结合单克隆筛选与直接悬浮驯化，可将周期压缩至4-6周。

3.遗传稳定性

● 风险：长期传代可能导致染色体变异或功能丢失。
● 监控措施：定期检测细胞核型、产物表达一致性及支原体污染。

五、应用与前景