嵌合抗原受体（CAR）是一类工程化的细胞表面受体，一般表达在T细胞上，介导工程化T细胞针对特定靶点肿瘤细胞的杀伤。其中针对CD19（一种B细胞表面标记蛋白）的两款CAR-T细胞疗法Kymriah（诺华）和Yescarta（吉利德）已经于2017年获得了FDA的批准，开创了CAR-T细胞疗法的元年。

       纵观CAR-T的发展史，第一代CAR-T只有CD3ζ链（ITAM，Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs）；第二代CAR-T添加了CD28或4-1BB等共刺激结构域（CM1），比如Kymriah和Yescarta；第三代CAR-T同时添加了CD28和4-1BB等两个共刺激结构域（CM1和CM2）；第四代CAR-T在第二代的基础上添加了共表达的细胞因子，比如IL-12等；第五代CAR-T同样基于第二代，添加了激活其它信号通路的共刺激结构域，比如IL2-2Rβ胞内结合SAAT3/5的结构域。这一代又一代各种不同的结构设计，赋予了CAR-T细胞疗法无限的生机和未来（图1）。

       图1：CAR-T细胞结构设计发展历程

       上述5代不同设计的CAR-T，虽然都是工程化组合不同信号分子结构域的结构，但仍局限在直接利用原始结构域的范畴内。比如使用CD3ζ链信号传导基序的天然序列（包含3个ITAM），或者使用CD28、4-1BB的胞内信号传导结构域的原始序列，对结构域本身并未做任何工程化改造。特别是CAR设计中最重要的CD3ζ结构域，几乎全都是包含3个ITAM结构域的胞内全长序列。然而近日纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Michel Sadelain及其团队在Nature Medicine上发表的一篇重磅研究指出使用CD3ζ链中的1个ITAM结构域的而不是全长，可以获得更强的肿瘤抑制活性，该研究或将开启未来CAR结构设计的全新思路。

       Michel Sadelain及其团队针对使用CD28-CD3ζ的CAR-T细胞较容易出现T细胞耗竭的现象，提出假设认为这可能是由于CD3ζ包含的3个ITAM结构域过度激活T细胞导致的。因此他们基于CD19-CD28-CD3ζ的经典CAR-T结构，设计了3种突变型CD3ζ结构域，分别突变失活了1个或2个ITAM结构域（图2）。结果在小鼠肿瘤模型中发现只有ITAM-1结构域有活性的CAR-T细胞（1XX）体内抗肿瘤活性反而更强，并且具有更长的持久力；而保留ITAM-3结构域活性的CAR-T细胞（XX3）抗肿瘤活性最差（图3）。

       图2：不同CD3ζ突变的CD19-CD28-CD3ζ结构，通过点突变技术废除了ITAM结构域的活性

       图3：小鼠肿瘤模型评价CAR-T细胞抑制肿瘤细胞的能力

       基于上述实验结果，研究者怀疑是不是由于ITAM-3结构域本身传导信号的能力较弱才导致只保留ITAM-3结构域活性的CAR-T细胞效果最差呢？因此他们设计了只含有ITAM-1或ITAM-3的CAR，结果发现它们都可以产生相当的、比经典的CAR-T更强的抑制肿瘤的活性（图4）。这些结果说明在CD19-CD28-CD3ζ结构中，ITAM的数量和所处的位置对CAR-T细胞抑制肿瘤的能力具有重要的影响，越靠近跨膜区的ITAM传导信号的能力越强。

       图4：截断CD3ζ的CAR结构设计和小鼠体内肿瘤抑制能力的评价

       在TCR信号传导中，CD3ζ的激活基序ITAM发挥着关键的作用。简单来说，当TCR-CD3与MHC-peptide结合后，一个叫做Lck的酪氨酸激酶磷酸化CD3ζ的ITAM结构域，磷酸化的ITAM招募并结合ZAP-70蛋白，招募的ZAP-70同样被Lck磷酸化并和Lck一起磷酸化其它的蛋白从而传导T细胞激活信号（图5）。

       图5：TCR-CD3信号通路主要相关蛋白

       在T细胞的天然激活过程中，CD3ζ的3个ITAM都是不可或缺的，但是为什么在CD19-CD28-CD3ζ结构的CAR-T细胞中只有一个ITAM反而会产生更强的肿瘤抑制活性呢？ Michel Sadelain等通过全基因组规模的转录图谱分析发现经典结构的CAR-T细胞更接近效应T细胞，1XX结构的CAR-T细胞更接近于记忆T细胞，而肿瘤抑制活性最差的XX3结构CAR-T细胞更接近于初始T细胞（图6）。所以在体内，同时具备一定效应T细胞和记忆T细胞能力的1XX结构CAR-T细胞具有更持久的肿瘤抑制活性也就不奇怪了。

       图6：3种CAR-T细胞表型分析

       最后笔者认为，在CD28作为共刺激结构域的CAR设计中，减少ITAM明显具有更强的优势；然而在基于4-1BB作为共刺激结构域的设计中，减少还是增加ITAM更有效果还需要实验验证。但最终的目标都是找到一个最合适的T细胞激活程度，过多或过少都不能发挥最强的肿瘤抑制活性，基于该设计的临床实验也在进行中，我们期待将来会有不错的数据公布。

       参考文献：

       1. Calibration of CAR activation potential directs alternative T cell fates and therapeutic potency.

       2. Selected signalling proteins recruited to the T cell receptor-CD3 complex.

       3. Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.

       笔者简介：Harry，分子生物学方向硕士，肿瘤免疫疗法从业人员，致力于为更好的肿瘤免疫疗法贡献一份力量。