抗体类生物治疗药物因其具有靶向性强、特异性好、治疗效果显著等优点，在生物药中占据越来越重要的地位。近年来，抗体药物获批数量显著增加，市场占有率节节攀升，成为生物药中增长最快的领域。随着抗体药物的需求不断加大，抗体技术的发展也日新月异，从多克隆抗体制备到单克隆抗体筛选，取得了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体到全人源抗体等一系列突破性的成果，抗体技术成为生物技术领域特别是生物医药领域研究的热点。

       根据发展历程，抗体技术可分为多克隆抗体技术、杂交瘤单克隆抗体技术和基因工程抗体技术3个阶段。多克隆抗体的制备多通过免疫动物获得，当抗原注射到动物体内后就会产生针对该抗原的抗体。大多数抗原表面成分复杂，具有多种不同的抗原表位，因而免疫血清中产生的抗体为针对多种抗原成分或抗原表位的、综合的、不均一的多克隆抗体。目前，恢复期患者血浆疗法用于急性病**传染病的应急治疗仍受到广泛关注，如在流感、埃博拉、严重急性呼吸综合征（SARS）及新型冠状病毒肺炎（COVID-19）流行期间均使用患者恢复期血浆疗法进行治疗或临床研究。杂交瘤单克隆抗体技术是将能够产生抗体的B淋巴细胞和能够无限繁殖的肿瘤细胞融合，融合后的子代细胞既可产生抗体，又能够无限传代，从而获得抗体纯度高、理化性质均一、特异性强的单克隆抗体。基因工程抗体技术是利用重组DNA和蛋白质工程技术等对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。利用基因工程抗体技术减少抗体鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成为第三代抗体技术。目前常见的技术包括鼠源抗体人源化技术，以及抗体文库展示技术、转基因小鼠技术和单细胞测序技术等人源抗体筛选技术。

       随着现代生物技术的不断发展，结合抗体药物的生物学特性，研发人员在传统抗体技术的基础上不断优化创新，力求通过更简便快速的方法，获得免疫原性更低、人体相容性更好及成本更低的治疗性抗体。

       1、杂交瘤单克隆抗体技术

       杂交瘤单克隆抗体技术是将免疫动物的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成在体外长期存活并能分泌免疫球蛋白的杂交瘤细胞，通过克隆化得到来自单个杂交瘤细胞的杂交瘤单克隆细胞系，生产大量单克隆抗体。此过程中，杂交瘤细胞 2 次筛选至关重要。最传统的二次杂交瘤筛选方法为有限稀释法。该方法操作简单，不需要特殊设备，但人工操作速度慢、效率低、耗时长、易出错，不能满足高通量筛选的要求。流式分选技术也较多用于杂交瘤细胞的筛选，该方法具有自动化速度快和精确度较高等优点，但需要对细胞进行荧光标记，且检测结果易受细胞周期影响。全自动细胞筛选系统（Cellcelector）是一种当前广泛应用的杂交瘤筛选技术，该技术具有高通量，自动化，高效率，可编程、量化和存档及追溯等优点，可缩短研发周期，降低成本。

       杂交瘤单克隆抗体技术方便、简单、成本低，但仅能用于鼠源抗体筛选。1986年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的第一个用杂交瘤技术筛选的鼠源抗体药物莫罗单抗（muromomab-CD3）。鼠源抗体能够被人体免疫系统识别，引起强烈的人抗鼠抗体反应，使得药物疗效减弱，并引起严重的不良反应。为解决这一问题，科学家利用基因工程方法对鼠源抗体进行人源化，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应。直至 1994 年，美国FDA 才批准了第二个抗体药物即人鼠嵌合抗体药物阿昔单抗（abciximab）上市。此后，通过杂交瘤技术筛选得到抗体通常需要进一步进行人源化改造，才能作为抗体药物进入临床应用。

       2、抗体文库展示技术

       抗体文库展示技术是近 30 多年快速发展起来的一项技术，主要用来筛选人源抗体。利用聚合酶链反应（PCR）从 B 细胞中扩增出抗体的重链和轻链群，将它们连入合适的载体表达随机的联合抗体文库。按抗体基因来源，目前抗体库主要有天然抗体库、半合成抗体库、全合成抗体库和混合抗体库等类型。同时，随着计算机辅助分析和虚拟设计的发展，还发展出表位特异性的靶向抗体库技术平台。根据抗体文库所用载体的不同，目前主要的技术有噬菌体展示技术、酵母表面展示技术、核糖体展示技术和mRNA展示技术等。

       噬菌体展示技术的基础为噬菌体侵蚀细菌并利用细菌表达自身外壳蛋白等过程。2002 年，美国 FDA 批准上市的首 个全人源抗体药物阿达木单抗（adalimumab）就是利用噬菌体展示文库筛选得到的。此外，具有结构简单、相对分子质量小、稳定性强、易于重组改造、组织穿透力强等优点的纳米抗体，也通常是利用免疫羊驼联合噬菌体展示文库技术筛选而来，如2018年9月美国 FDA 批准上市的纳米抗体药物-卡普赛珠单抗（caplacizumab）。

       酵母细胞表面展示技术是一项真核蛋白展示技术。作为真核表达系统，酵母细胞表面展示技术可以对蛋白进行翻译后修饰，且真核分泌系统有"质量"控制机制，能阻止错误折叠的蛋白被输运出内质网。此外，可使用流式细胞术对已构建的酵母细胞库进行定量和实时筛选，高效便捷。2020年，美国FDA批准在巴斯德毕赤酵母细胞表达得到的抗体药物依普奈珠单抗（eptinezumab）上市，使其成为首 个酵母表达的抗体药物。目前该技术也被用于纳米抗体的开发。

       核糖体展示技术和mRNA展示技术作为新兴的克隆展示技术，完全在体外进行。通过构建 DNA 文库，在体外进行转录与翻译，最终形成"mRNA-核糖体-蛋白质"（核糖体展示技术）或"cDNAmRNA-蛋白质"（mRNA 展示技术）三聚体，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白质）联系起来，最后从中分离 mRNA 或 cDNA 进行逆转录 PCR（RT-PCR）扩增。该类技术与噬菌体或酵母细胞展示技术相比，具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、可通过引入突变和重组技术提高靶标蛋白亲和力等优点。同时，mRNA展示技术经逆转录形成的 cDNA/mRNA 杂交双链，还避免了RNA 二级结构和三级结构对体外筛选的干扰。目前，越来越多的研究人员将该类技术应用于新药开发领域。

相关阅读：《抗体技术的研发现状与进展（下篇）》

       参考资料

       [1]武瑞君,桑晓冬,李治非,敖翼,范玲.抗体技术的研发现状与展望[J].中国药理学与毒理学杂志,2021,35(05):374-381.

       [2]冯健男,乔春霞.人源治疗性抗体研发技术进展[J].南京医科大学学报(自然科学版),2020,40(11):1571-1574.

       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。