分析检测支持伴随着生物药开发的各个阶段，根据不同的检测目的，检测人员会选择相应的分析方法。例如在早期的药物发现阶段，由于材料受限以及对检测速度的要求，通常选择高灵敏度、高通量的分析方法来进行筛选和检测；而在药物开发后期，检测量要求放低，但要求检测方法具有稳定性，且相对比较常规。今天我们围绕抗体偶联药物（ADC）的质量分析研究进行分享。

       ADC药物的分析和表征包括多个方面：

       ● 一级结构中氨基酸序列的分析、完整抗体的分析

       ● 高级结构的二硫键分析、自由巯基的分析、圆二色谱、红外以及DSC的分析

       ● 纯度和异质性需要进行SEC、CE以及IEX检测

       ● 生物活性的检测，包括了抗原抗体结合活性/细胞活性的检测、ADCC/CDC的检测

       ● ADC特异检测，包括DAR值分析、小分子分布的分析、Free drug检测、空载linker比率的检测、小分子偶联位点的检测

       ● 翻译后修饰的检测，包括糖基化分析、氧化、脱酰胺化、糖化以及N端和C端的分析

       ● 此外还有很多常规的分析，例如三大残留、吐温分析、无菌等

       ADC药物的质量属性涉及到大分子的质量属性、ADC特有的质量属性以及小分子相关的质量属性。

       ● ADC中与大分子相关的质量属性检测包括：完整分子量、肽图、聚体、碎片、电荷异质性、翻译后修饰以及大分子活性相关的检测；

       ● ADC特有的质量属性相关检测包括：裸抗、DAR值分析、小分子药物分布、偶联位点的分析；

       ● 小分子相关的质量属性包含：Free drug及相关杂质、小分子活性检测以及其他杂质的分析，如有机试剂残留、重金属残留等。

       以定点偶联为例，定点偶联通常对半胱氨酸进行工程化改造，引入非天然的氨基酸或是用酶进行偶联，这种偶联方法制备的ADC通常是均质的。半胱氨酸偶联的ADC通常连接在链间二硫键，小分子以0、2、4、6、8的形式连接在抗体上，可以用疏水色谱或反向色谱进行DAR值的分析。

       下图为疏水色谱检测半胱氨酸偶联ADC的结果。由图可知，疏水色谱对于连接了0、2、4、6、8个小分子药的ADC分离效果较好，通过对谱图进行积分即可计算DAR值。使用反向色谱检测ADC也可以进行DAR值的计算，在检测前需要先对ADC进行还原，得到谱图后发现反相色谱对轻链带一个小分子药、重链带1、2、3个小分子药的不同ADC均能良好分离，也可以通过谱图积分进行DAR值的计算。

       对于赖氨酸偶联的ADC药物，例如T-DM1，可以采用LC-MS对小分子药的分布进行大概的分析及DAR值计算。使用紫外分析时，在252 nm处会出现小分子特定吸收峰，280 nm处出现蛋白特定吸收峰。根据朗伯比尔定律，可以计算出该ADC的DAR值。iCIEF同样可以检测ADC药物的小分子分布情况。随着等电点升高，ADC偶联的小分子数量会减少。

       T-DM1的偶联分为两步来实现：第一步是通过还原的方法，将SMCC随机偶联到抗体的赖氨酸位点上，在这个过程中MCC中的马来酰亚胺可能发生迈克尔加成作用，在分子间或是分子内部形成T-MCC共价交联，这种共价键无法通过还原来打断。

       下图是对连接上小分子的T-DM1以及只做了一步偶联的T-MCC进行了CE分析的结果。nrCE的谱图中主峰之后出现的小峰，推测是共价交联导致的。rCE谱图中重链后出现的峰，也是共价交联引起的。

       东曜药业对自身生产的T-DM1与罗氏所生产的原研Kadcyla^®进行了相似性研究，基于风险评估，对不同的质量属性进行分级，并设定了三种不同的可接受标准。

       ►第一层级

       可以直接反映ADC作用机制，并且对临床输出有很大影响的质量属性归类为第一层级，如增殖抑制实验。第一层级使用等价实验作为可接受标准。在90%的置信区间，相似药与参照药均值的差值要在参照药均值的±1.5倍SD范围内。

       ►第二层级

       对于临床输出影响中等的质量属性归为第二层级，使用质量范围作为评价标准，例如Her-2抗原抗体结合实验。第二层级要求相似药有大于90%的批次是在参照药均值的±3倍SD范围内。

       ►第三层级

       对临床输出影响较小的质量属性归为第三层级，通常进行谱图比较，如肽图。经过分析，东曜药业生产的T-DM1与Kadcyla^®的肽图具有很高的相似度（见下图）。

       东曜药业提供从临床前到临床以及商业化生产等不同阶段服务，包括技术开发、分析方法的开发和验证、技术转移、工艺的表征和验证等，具备生化分析、理化分析、细胞活性分析以及表征能力：

       生化分析包括抗原抗体结合、三大残留的检测、FC受体结合、基因拷贝数以及支原体的检测等；

       理化分析包括蛋白含量、纯度分析、肽图分析、电荷异质性、DAR值分析、N糖、唾液酸残留检测以及吐温检测等；

       细胞活性包括细胞毒检测、ADCC/CDC免疫功能实验、报告基因实验、基因表达、病毒的含量；

       表征可以实现完整抗体还原抗体分子量的检测序列覆盖度、二硫键翻译后修饰，以及 ADC相关检测，例如小分子分布、空载linker的比率分析等；

       方法验证遵照 ICH Q2指导原则，符合中国、美国以及欧洲的药典标准。基于不同的目的，可以对专属性、准确度、精密度、检测限、定量限、线性范围以及耐用性做不同程度的验证。