当前核酸药物开发可分为化学改造和物理改性两大方向，二者可单独或共同提升核酸药物体内外稳定性和特定组织、细胞内的翻译效率。目前已开发出多种核酸改造和递送技术，主要包括化学修饰、配体偶联和纳米递送载体。

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       纳米递送载体

       1、无机纳米载体

       无机纳米载体是以无机物为主体的递送系统，常用的无机纳米材料有金、银、磷酸钙、氧化石墨烯、量子点和磁性纳米材料如氧化铁等。无机纳米材料因其独特的电学、光学性质和生物相容性以及低细胞毒性的特点而备受关注。金纳米材料具有柔性表面，可以使核酸直接与金纳米粒结合。有学者利用i-motif 二级结构制作一种pH敏感的siRNA-金纳米粒递送系统，可通过siRNA沉默 PLK1（编码稳定染色体和有丝分裂所必需的酶），进而诱导靶细胞凋亡。pH 梯度变化可引起核酸构象改变，诱导 siRNA-金纳米粒聚集，促进体内逃逸，从而释放 siRNA。干细胞难以摄取外来物质，很难使用传统的非病毒载体进行药物递送。研究利用HIV-TAT肽对金纳米粒和银纳米粒进行功能化修饰，载体可以有效穿透表皮干细胞，且毒性较低。量子点是一种基于半导体的单分散纳米晶体，碳量子点是其中最典型的应用之一，其尺寸通常小于 10 nm，碳量子点具有低毒性、高量子产率、低光漂白、良好的水溶性、易于表面修饰和化学性能稳定的特点。PEI、乙二胺、精胺和精氨酸等表面修饰已广泛应用于碳量子点，且携带阳离子化合物的碳量子点可以有效地将治疗性质粒转染到细胞中。碳量子点可用于癌症靶向治疗，利用叶酸修饰掺杂了氮的碳量子点，与自噬抑制剂组合，可实现快速（24 h内）抑制肿瘤细胞生长且杀伤效果显著。另外，碳量子点还可以作为一种高效的荧光探针，实现核酸标记和体内动态分布的实时跟踪。例如用脂质体包裹碳量子点可用于血管中肿瘤扩增的成像，运用碳量子点来递送 siRNA 可进行“可视化”的肺癌治疗。石墨烯是碳的同素异形体，由于其独特的光学、热学和电学特性，成为一种新型纳米材料。氧化石墨烯存在 π-π 堆叠非共价相互作用，可以提高药物装载能力并实现受控释放。由PEG、PEI 和氧化石墨烯组成的一种刺激响应型核酸递送载体，氧化石墨烯纳米粒吸收近红外辐射时，局部温度升高，导致内体破裂，实现受控释放。同时，氧化石墨烯具有较高负载力，可以将氧化石墨烯、PEI 和聚 4-苯乙烯磺酸钠组装成纳米复合物来同时递送 miRNA 药物和抗癌药物阿霉素。

       2、脂质纳米颗粒递送系统

       基于脂质的纳米载体是核酸药物递送领域的研究热点。脂质本身即是细胞膜的主要成分，其易于与细胞膜的磷脂双分子层相融合，可以提高纳米载体的细胞摄入。而且，脂质易于购买、生物相容性好、可生物降解，还可以通过化学修饰提高载体靶向性。目前研究涉及的脂质纳米载体包括脂质复合物（lipoplex）、脂质聚合物复合物（lipopolyplex）、层状纳米颗粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carrier，NLC），以及稳定的核酸脂质粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

       ①脂质复合物。通过电性吸引将核酸药物与阳离子脂质，如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA）等混合后直接形成脂质复合物是最简单的递送思路。脂质复合物的表面带正电荷，便于结合带负电荷的细胞膜继而进入细胞，但其在体内环境中会与带负电荷生物大分子发生作用，导致带负电荷的核酸药物被置换从而发生泄漏，同时产生电荷相关的生理毒性。另外，脂质复合物剂型稳定性不理想，需要在使用前即时配制。

       ②脂质聚合物复合物。脂质聚合物复合物系将阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺树形分子（PAMAM dendrimer）等与核酸药物形成的表面带正电的聚合物复合物通过电性吸引包裹脂质双分子层得到，形成的纳米颗粒表面基本不带正电荷。相较于脂质复合物，脂质体聚合物复合物可以显著提高递送效率，且稳定性明显提高。通过加入透明质酸或肝素对复合物表面进行修饰，其免疫刺激性可进一步降低。

       ③层状纳米颗粒。层状纳米颗粒通过序列的电性作用将核酸药物包裹进多层的纳米颗粒。中心稳定的纳米核心及各层材料的选择对相邻层之间的吸附至关重要。如使用电负性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）颗粒作为核心，首先将聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以产生带正电荷的表面，再以电负性的siRNA 进行覆盖，再覆盖一层带正电荷的聚精氨酸，最后用偶联了 CD20 抗体的带负电荷的透明质酸覆层。该多层纳米颗粒最外层的负电荷层可以避免产生正电荷相关毒性，其在动物实验中未见明显的毒性。但层状纳米颗粒的材料选择要求较高且制备工艺复杂、重现性差，限制了其应用。

       ④固体脂质纳米粒（SLN）和纳米结构脂质载体。固体脂质纳米粒具有低熔点的固体阳离子脂质核心，核酸药物吸附于载体基质表面，通过外围的表面活性剂使之稳定。但研究发现，SLN 可能会随着内部固体脂质晶体的逐渐生长导致药物泄漏。纳米结构脂质载体为其升级版本，在基质中掺入少量的液体脂质，降低了脂质核心的结晶程度，不仅提高了载药量，还具有更好的物理和化学稳定性。由于固态脂质核也可进行载药，固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体可以对亲脂性药物进行递送。使用固体脂质纳米粒对Bcl-2 siRNA 和紫杉醇同时包载，体外结果显示这2种药物可以同时释放。

       ⑤稳定的核酸脂质粒子。稳定的核酸脂质粒子（SNALP）是一种含有可离子化阳离子脂质的脂质纳米粒（LNP），由正电/可离子化脂质、结构脂质、PEG 脂质及胆固醇组成，可有效阻止核酸药物在内源性环境中的降解，将药物递送至细胞内。基于其技术和商业上的成功导致的巨大影响，许多文献中的LNP均特指SNALP。LNP粒径通常为20～200 nm，该大小可帮助LNP 克服体液 (如血液和淋巴液) 的剪切并穿过组织间隙。研究表明，LNP 在体内主要通过与载脂蛋白E (apoli‐poprotein E，ApoE) 形成复合物，在低密度脂蛋白受体介导的内吞后由CLs/ILs 介导的内体逃逸进入细胞质。LNP 的体内分布与处方及相关受体密切相关，LNP 的处方研究是当前 RNA 递送的研究热点和难点。

       目前，已有3个使用此类递送系统的产品获批上市，分别为阿尼拉姆公司开发的治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）的 siRNA 药物 patisiran（商品名：Onpattro），以及用于预防新冠病毒感染的mRNA疫苗 Comirnaty 和 Spikevax。可离子化阳离子脂质的使用和微流控混合技术的出现使得载药颗粒的表面基本不带电。可离子化阳离子脂质在酸性条件下带正电荷，而在体内循环系统的环境中几乎不带电。脂质纳米粒制备时，在pH 约4的条件下，通过快速混合脂质的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成实心的脂质颗粒。将其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存备用，脂质颗粒表面近中性。

       SNALP 通过一系列巧妙的设计获得了商业上的成功，但其存在的问题也比较明显。首先，其递送效率有限，为达到治疗效果需要较高的给药剂量。但是，作为一种使用了多种脂质辅料的注射剂，辅料的毒性不可忽视。另外，PEG 脂质被报道可引起超敏反应，阳离子脂质也具有一定的促炎性。例如，Onpattro 在注射之前需要使用抗组胺药和激素药物控制。随着同样靶向肝脏的更高效递送系统-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶联递送系统的出现，SNALP 已逐渐退出 siRNA递送领域。但对于生物利用度更差、荷电更高的mRNA及CRISPR 基因编辑药物，LNP递送系统目前仍是解决其递送难题最有效的方式。

       经过近半个世纪的积累，递送技术逐渐成熟，使核酸药物进入了快速增长期。核酸药物在治疗遗传性疾病方面具有天然优势，为众多罕见病患者提供了宝贵的治疗机会。核酸药物递送技术的发展呈现出平台化的特点，在递送技术相对成熟后，基于相同技术平台开发类似药物的速度会明显加快。如借助前期脂质纳米粒的技术沉淀，Moderna公司的mRNA 新冠疫苗从疫苗序列选择设计完成到首次人体给药，合计仅耗时63 d，展现了超乎以往想象的效率。可以预见，已有的技术平台未来也非常有希望应用于体内基因编辑等新的治疗领域。同时，核酸药物的递送仍面临众多技术挑战。如何进一步提高递送效率、降低递送系统的毒性、实现对其他肝脏外组织和器官的特异性递送将是该领域的研究热点。伴随着对核酸体内作用机制和相关疾病认识的进一步深入，核酸药物递送系统必将迎来新的突破和发展，助力于提供安全有效的个性化治疗方案，使更多患者受益。

       参考资料

       [1]陈欢，魏利军.RNA药物非病毒递送系统研究进展[J].药学进展，2022，46(11):

       [2]李丹，黄宇坤，高小玲.RNA药物递送研究进展[J].药学学报，2023，58(03):

       [3]王峻峰，谭曼曼，王颖等.核酸类药物的修饰和递送研究进展[J].浙江大学学报(医学版)，2023，52(04):

       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证