近日，华人抗体协会旗下期刊、牛津大学出版社出版的Antibody Therapeutics发表了一篇原文标题为“Biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics”[1]的综述论文。该论文的英文全文可通过如下链接来免费获得：https://academic.oup.com/abt/article/3/1/18/5739255

       第一作者和共同通讯作者为药明生物（WuXi Biologics）的聂思惟博士，资深共同通讯作者为药明生物执行副总裁、首席科学官顾继杰博士，顾博士同时也是mAbs和Antibody Therapeutics的编委，此前他曾在雅培和艾伯维长期从事抗体工程和靶点生物学方面的抗体药物研发工作。除了文中列出的其他来自药明生物的作者之外，此文还有三位作者来自科睿唯安（Clarivate Analytics），作者借助于科睿唯安的Cortellis数据库，使此文中的数据更加详实可靠。本文意在对这篇综述进行简要介绍。

       论文摘要和亮点

       双特异性抗体（Bispecific Antibody本文以下简称双抗），是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或者与同一抗原的两个不同抗原表位相结合。双抗的概念已经提出一个甲子整整六十年了，理想的双抗在临床前研究和临床治疗上比混合使用两个单抗更有优势，是因为其具有区别于单抗的独特生物学机理，为研发新型治疗方法提供了更多路径。随着业界对各种天然或者人工合成的双抗的结构、生物合成的研究不断深入，双抗在过去十年迎来了巨大的发展，也取得了可观的成就。截止2019年9月，超过110种双抗处于临床开发阶段，接近180种处于临床前开发阶段。

       目前双抗研究如雨后春笋不断涌现，本文作者借助于科睿唯安的Cortellis数据库，首次系统性地对目前处于临床前和临床阶段的抗体进行分类，将现有双抗进展全面、直观地呈现给读者。根据抗原结合域以及是否包含Fc片段，作者把双抗格式分为30个主要类别，并详细介绍了目前处于临床前和临床阶段大约290种双抗的生物学作用机制。作者期望通过阐述三个原则，即生物学机理驱动，双抗格式（format）匹配，以及用六个要素指导来正确地选择进入临床阶段的双抗候选分子，来解决临床治疗需求。目前各种新型双抗模式不断涌现，作用机制也非常新颖，与此同时这些双抗潜在的安全风险以及风险/收益比应该在临床前和临床阶段得到评估。尽管如此，作者仍然乐观预测，未来十年将看到一些具有全新作用机理的双抗或者多抗在临床上的成功表现，并且预测我们将见证下一个抗体药开发高速发展的新浪潮。

       这篇综述论文主要包括如下几个方面：

       1、抗体发展史

       2、双抗设计的原则

       3、双抗格式分类

       4、双抗研发和市场现状的分析

       5、双抗分子的生物学机理及其临床应用分类

       6、选择最优格式来实现双抗分子的生物学机理

       7、根据六个要素来优化及确定最终的双抗候选药物分子

       8、目前双抗临床上仍然存在的挑战

       9、最后展望未来双抗或者多抗的发展

       一、抗体发展史

       首先，作者简单回顾了单克隆抗体的发展史：1975年杂交瘤技术出现，使得单克隆抗体发展进入新世纪。然而，由于免疫原性等原因，在1975 – 1986年之间大部分单抗的研发都以失败而告终，只有一个针对CD3的鼠源单克隆抗体Muromonab（商品名为Orthoclone OKT3）获批。在前期失败的经验基础上，又是一个十年过去了。为了解决免疫原性的问题，嵌合抗体、人源化抗体以及全人抗体等新技术应运而生。1997年，美国FDA批准利妥昔单克隆抗体（Rituximab）上市，标志着抗体研发进入一个爆发的新世纪。至今约23年以来，全球大约100种抗体类药物获批上市，抗体药物俨然成为了当前最受瞩目的新疗法以及各大药厂研究的新宠和焦点。

       类似于单克隆抗体的发展进程，双抗的研发历史也经历了类似的发展—困境—突破的过程。其详细发展史可参考2019年Nature Reviews Drug Discovery发表的综述论文[2]。从上个世纪60年代，科学家们首次尝试从多克隆抗体血清中分离出两个Fab片段，并在体外重新组装成双特异的F(ab‘)2分子开始，经过了20多年的努力，Fab、Fv、scFv、VHH等结构的特异性终于逐步被研究清楚，从而突破了一直阻碍双抗开发的免疫原性、稳定性、溶解性，生物学机理以及工业化生产等困境。在2014年，Blincyto临床获批标志着双抗用于实现全新治疗概念的广阔前景在临床得到了验证，这极大地激励了制药工业界对双抗研发的热情。

       二、抗体设计的原则

       基于抗体研发的困难，作者首次提出如何设计鉴别有潜力的新型双抗或者多抗的三个原则和六个要素（图1-A）：

       1. Driven by biology：双抗分子结构设计应该由生物学机理驱动，双抗的设计应以能实现其预期的生物学功能为前提，并兼顾有效性和安全性。

       2. Match biology with an optimal format：双抗的格式应该和生物学机理匹配，这和上述第一点是一致的，不能只是为了不同而设计出新型双抗。

       3. Select a right molecule：选择一个可以进入临床研究的理想双抗分子需要满足六个要素，即：a) Efficacy-理想的临床疗效；b) Safety-合适的安全性；c) PK/PD-合理的药代动力学；d) Physicochemical-合理的理化特性；e) Manufacturability-生产性，即易于临床和商业化生产；f) Immunogenicity-尽可能小的免疫原性（参见图1A & 1B）。

图1： 图1A: 双抗开发的三大原则； 图1B: 选择合适双抗分子的六个要素

       然而，目前很多抗体在研发阶段并未完全遵从或忽视了三个原则和六个要素，挑战之处是与生物功能相关的指标（如有效性、安全性、PK/PD和免疫原性）和可开发性指标（如表达水平、可溶性、稳定性、粘度等）往往并不完全相关，有时甚至相互矛盾。因此，如何选择一个理想的双抗分子需要全局考量，这对后期临床开发的成功至关重要，需在早期发现和开发阶段被给予更多重视。

       三、抗体分类

       作者将290种目前处于临床前期和临床阶段的双抗和多种抗体，采用两种分类方式：第一，根据结构分类；第二，根据功能分类。

       1. 结构分类（参见图2）

       对于形式繁多的双抗分子，作者将由五大类抗原结合域（SDA，Fv，ScFv，Fab，ScFab）组成的双抗分子根据其是否含有Fc片段一共分为30类（如图2所示），并根据该分类节选部分抗体展现给读者。

       下面5种类型抗体片段是构建双抗分子最为重要的模块，即：

       1）SDA（single domain antibody）：单域抗体，也称为VHH，是指只含有抗体重链可变区结构；

       2）Fv：包含两个肽链，重链可变区VH和轻链可变区VL；

       3）ScFv：同样包含重链可变区VH和轻链可变区VL，但是通过linker的形式将VH和VL链接在一起成为单一肽链；

       4）Fab：含有两个肽链，一个是重链可变区VH和恒定区CH，另一个含有轻链可变区VL和恒定区CL；

       5）ScFab：通过linker将Fab的两个肽链连接起来。

       作者认为，双抗分子形式上的多样性是由其功能和应用上的不同需求所决定的。根据不同的目的分子画像(Target Product Profile, TPP)，双抗分子的大小、结构域的组合、与抗原结合的亲和力和价位、以及其结构上的灵活性等因素都需要仔细的选择和小心的设计。

图2，30类双特异抗体分类及举例

       2. 功能分类（英文原文表1-6）

       2014年，安进（Amgen）研发的用于治疗急性白细胞血症Blincyto获批上市，正式标志着双抗在临床上的应用成功获得验证。 但是直到三年后，另一款双抗——由罗氏旗下的基因泰克（Genentech)开发的Hemlibra才被美国FDA批准用于治疗血友病。目前绝大多数双抗仍处于临床早期研究阶段（67%处于临床I期，25%处于临床II期），只有5个双抗进入临床III期。在目前处于临床阶段的双抗中，约有84%用于治疗癌症。有部分双抗正在被开发用于治疗自身免疫系统疾病。目前拥有最多处于临床开发阶段双抗的公司是安进，其次是MacroGenics、礼来、强生旗下的Janssen、罗氏、赛诺菲以及Xencor。接近一半的双抗是通过CD3激活T细胞或者通过CD16激活NK细胞杀伤肿瘤细胞；另外一个普遍的策略是特异性地限制双抗仅在肿瘤环境中产生效果，从而降低对正常细胞或者组织的损伤。许多公司都拥有其独特的双抗技术平台，例如安进的BiTE、MacroGenics的DART、和罗氏的CrossMab平台。

       随着双抗和多抗技术平台涌现，在过去3年中，处于临床阶段的双抗交易（不包括公司兼并收购）数量增长了140%，达到68亿美元的总交易额。其中，38亿美元集中在肿瘤领域，10亿美元针对感染性疾病领域。

       2018年全球双抗总销售额为4.6亿美元，主要被安进Blincyto（2.3亿美元）和罗氏Hemlibra（2.29亿美元）占据。据预测，至2024年，Hembira的销售额会快速增长到39.6亿美元，而Blincyto的增速则会略缓和。随着Hemlibra销售剧增以及潜在的新型双抗或者多抗获批，双抗或者多抗市场2024年会飙升到54.3亿美元。

       本文作者利用Cortellis数据库分析了截止2019年9月所有处于临床前或临床阶段的双抗，176种双抗或者多抗处于临床前期研究，119种处于临床阶段（包括从IND申请至临床III期，以及2个研究处于暂停阶段），作者采用非常直观的网络关系图将290种抗体汇总于下图3（即英文原文图6），涉及的靶点关系一目了然。

       图3

       作者根据双抗或双功能蛋白的治疗领域将其分为抗肿瘤、针对自身免疫系统疾病、以及针对其他疾病的三大类。

       2.1 抗肿瘤双抗

       根据Cortellis数据库分析，目前双抗管线以抗肿瘤产品居多，在119种处于临床阶段和176种处于临床前的双抗项目中，分别有99个和153个项目是针对肿瘤领域。作者根据生物学机理将抗肿瘤双抗项目进一步分为以下五类：

       2.1.1）抗血管生成（Anti-angiogenesis)：血管生成促进肿瘤的生长，促进其恶化、扩散和转移，抗血管生成在抗肿瘤中的作用已经被广泛应用。双抗分子能同时阻断两个，甚至多个血管生成的通路，例如VEGF、VEGFR2、DLL4以及ANGPT2，来增强抗血管生成的效果（英文原文表1）。

       2.1.2）抗肿瘤生成（Anti-tumorigenesis）：靶向致癌受体也是被广泛使用的抗肿瘤手段之一。在这类双抗项目中，大部分靶点为HER2、HER3、EGFR、cMet、以及LRP5/6等（英文原文表1）。

       2.1.3）增强抗肿瘤免疫（Enhancing tumor immunity）：肿瘤免疫治疗旨在提高病人自身抗肿瘤免疫反应，这主要可以通过增强T 细胞辅助激活信号（即“踩油门”），例如4-1BB、OX40等；或阻断T细胞反应抑制信号（即“松刹车”），例如临床上取得巨大成就的抗CTLA4和抗PD1/PD-L1治疗。虽然如此，也只有10-30%的病人能受益于PD-1/CTLA4抗体治疗。通过同时阻断两个不同的T细胞反应抑制信号，双抗项目能进一步提高“松刹车”的效果。相较于“松刹车”，“踩油门”的肿瘤免疫治疗开发由于其安全性或疗效等问题一直没有突破性的进展。双抗分子可以通过其巧妙的设计，达到在局部肿瘤部位特异性地激活免疫共刺激信号，从而在提高病人抗肿瘤免疫反应的同时降低这类治疗中伴随的副作用。目前临床前和临床期分别有10种和19种这类双抗分子在研（英文原文表2）。

       2.1.4）调节肿瘤微环境（Modulating tumor microenvironment (TME))：为了逃逸免疫系统监控，肿瘤可以通过表达免疫抑制分子（如TGFβ、CD73）和招募免疫抑制细胞，来抑制肿瘤微环境中的免疫细胞的功能和增殖。有部分双抗和双功能蛋白被开发用于克服肿瘤微环境中的免疫抑制作用（英文原文表3）。

       2.1.5）靶向肿瘤细胞的清除（Depletion of target cells）：这个类型体现了目前绝大多数在研双抗的生物学机制，即通过介导效应细胞或者通过Fc介导的ADCC、ADCP以及CDC等功能，直接靶向肿瘤细胞达到清除的目的（英文原文表4）。

       2.2 抗炎双抗

       自身免疫系统疾病是双抗第二大应用领域，目前分别有10个及12个双抗项目处于临床及临床前阶段。这些双抗项目大部分都是通过同时中和多个促炎因子的功能来达到比单抗更好的抑制炎症反应的功效。在研的这类双抗有：IL-1α x IL-1β、IL-17 x IL-13、IL-4 x IL-13和BAFF x IL-17等（英文原文表5）。

       2.3 用于治疗其他疾病的双抗

       例如血友病、眼部疾病、神经疾病、感染性疾病和糖尿病等领域均有双抗或双功能蛋白在进行研究和开发（详情请参考英文原文表6）。

       四、如何构建双抗或者多抗实现其特殊生物学特性

       双抗不同的结构形式可以赋予双抗分子不同的生物学活性，作者通过讨论以下五个构建双抗的因素来阐述这些因素对双抗功能的影响：

       1. 抗原-抗体亲和力和抗体效价：

       1.1. 亲和力：通常抗原-抗体间的特异性结合具有较强的亲和力，然而在构建双抗时，并不是亲和力越强越好，而是要因“Target”而异。对于那些以依靠表面受体聚集从而被激活的受体，fast-on、fast-off结合动力学更适合于受体的招募；相反，如果是配体和受体相结合导致受体构象变化的激活，那么slow off结合动力学更适合受体的持久变构和下游信号通路的激活，从而提高生物学功能。

       1.2. 抗体价位：抗体价位的设计对实现双抗的功能至关重要。比如，T cell engager为了实现严格的肿瘤依赖性的T细胞激活，一般这类双抗分子都会采用单价的CD3 结合方式；然而，靶向肿瘤细胞表面分子（TAA）的抗体价数则需要根据该TAA的特性来决定，例如其肿瘤特异性、胞外端的大小和构象、在肿瘤和正常细胞表达上的差异，以及机体对最大化杀死阳性细胞的耐受性。

       2. 抗原结合表位、几何结构

       2.1.  抗原结合表位：双抗所需要实现的功能不同，所选的抗原结合表位也不相同。例如拮抗型双抗需要阻断某个信号通路，那么只要该双抗能结合在阻止下游信号激活的结合表位，例如阻断配体和受体的结合，或是阻断受体共聚集至免疫突触中去（例如PD-1），就都能有效地阻断信号通路的激活，从而发挥治疗效果；

       2.2. 几何结构（Geometry）：这个因素在T cell engager中有更为突出的体现。为了实现T细胞的激活，需要将T细胞和靶向细胞拉到一个特定距离（~14 nM），形成免疫突触，从而引起T细胞的激活，减少非特异性细胞杀伤，那么抗体表位和靶向细胞之间的距离以及两个不同抗原之间的距离就非常重要。同时双抗的大小可能直接影响其是否能有效地在T细胞和肿瘤细胞间形成免疫突触，因而此因素可以被巧妙地用于调节治疗窗口。

       3. 连接子（Linker）的设计：用来连接两个不同抗体的连接子长度、灵活性、氨基酸组成以及连接IgG区的铰链区对有效构建双抗都很重要。

       4. 抗体大小：双抗在血液瘤治疗中已经取得了可观的成就，然而在实体瘤中还需更多研究，其中一个难点就在于如何让双抗能更有效的进入肿瘤并发挥作用。相较于分子量大的双抗，分子量小的双抗更容易通过血管渗出快速进入实体瘤，然而其在血液中的半衰期非常短，因此能进入实体瘤的分子数也相应减少，从而限制了其在实体瘤中的应用。

       5. Fc区的选择：Fc也是一个能显著影响双抗功能的区域。

       5.1. Fc IgG亚型：例如IgG亚型铰链区的灵活性对T cell engager是否能有效在T细胞和肿瘤细胞间形成免疫突触非常重要，IgG2的铰链区不仅短而且非常不灵活，不利于免疫突触的形成，因此将其区域替换成IgG1/IgG4的铰链区，就会大大提高其功能；

       5.2. Fc的效应器功能：Fc可以和其受体结合介导多种生物学功能，如ADCC，ADCP等。但是在某些情况下，Fc的效应器功能是应该被避免的，如T cell engager要避免非肿瘤依赖的T细胞激活，这类双抗的Fc区会被突变来降低甚至完全消除Fc与FcγR的结合。

       五、选择合适的分子以实现对抗体功能和可开发性的要求

       作者在此详细讨论了六个要素，即Efficacy，Safety，PK/PD property，Physiochemical property，Manufacturability和Immunogenicity，对双抗分子开发的决定性的影响。

       1. 有效性和安全性：有效性和安全性是一个好的双抗分子进入临床阶段的先决条件，同时和PK/PD相互影响。有的双抗在临床前阶段研究展示出非常好的体外效果，但是却在临床阶段显示了很大的毒副作用因此限制了其应用。例如于2014年已经被FDA批准的Blinatumomab (CD19 x CD3)，用于二线治疗急性淋巴细胞白血病。该双抗属于T cell engager，可以有效地清除CD19阳性的B淋巴癌细胞，但有可能在治疗过程中引起威胁生命的副作用。对于如何构建有效并且低**的T cell engager，Diego Ellerman[3]提出可以通过降低CD3 抗体的亲和力，寻找新的结合表位，构建新的抗体结构模式等途径来实现；

       2. 药物代谢动力学和药效学特性（PK/PD）：PK是指药物进入机体后在体内的吸收、分布、代谢以及排泄；PD是指药物对机体的作用和机制，并且阐明药物在治疗疾病的机制。PK/PD是双抗研发的有效性和安全性中非常重要的一个因素。双抗有许多性质可以影响其PK和PD特性，例如双抗的结构组成、大小、理化特性、是否含有Fc以及靶点结合亲和力；

       3. 理化特性和可生产性：一个好的进入临床阶段的双抗，应该1)易于表达生产正确组装的双抗分子；2)没有或者很少的聚集体以减少免疫原性；3)溶解度高、稳定性高、粘度低；

       4. 免疫原性：是限制生物药在临床应用的主要因素之一，也是引起药物快速清除、中和药物有效性以及引起临床副作用的主要原因。因为大部分双抗分子都经过多重分子改造，无论从三维结构还是序列都可能与天然抗体有很大的差别，因此可能更容易产生抗药抗体。

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       六、双抗开发面临的挑战

       综合以上双抗研发需要考虑的六个要素，作者总结了目前双抗开发面临的主要挑战，具体可以简单分为两个方面：技术挑战和生物机理挑战。

       1. 技术挑战

       1.1. 发现（discovery)：和一般单抗相比，一些双抗具有独特的生物学效应，从而需要特殊的和更加复杂的检测系统来评估其潜在的疗效、毒理、和PK/PD等性质；

       1.2. CMC：虽然随着双抗领域的快速发展，双抗的理化特性和可生产性不再是影响双抗开发的主要障碍。然而，不同双抗形式也会影响后期CMC开发的难度，那些满足可开发性条件的双抗显然可以降低开发难度并缩短开发时间；

       1.3. 临床前药理学和毒理：临床前的药理学和毒理对于双抗开发也至关重要，临床前的药理学和毒理的数据为首次临床用药的剂量选择提供了重要信息。而由于双抗同时靶向两个抗原，其临床前的药理学和毒理实验模型的选择比单抗要更加复杂和困难；

       1.4. 临床开发：根据2019年4月FDA发布的关于双抗开发的指南，以下几个因素在临床开发中需要纳入考虑范围，包括科学合理性、靶点作用机制、靶点结合动力学、PK/PD和安全性。

       2. 生物机制上的挑战

       双抗最引人注目的应用在于其可以实现独特的生物学功能和作用机理。然而新颖的作用机理可能会带来潜在的未知安全隐患，威胁病人的生命健康。然而遗憾的是，这些风险在临床前研究时是很难被预测的，因此双抗的生物学效应和安全性的不确定性是双抗研发的一个主要的挑战。在选择靶点配对时，研发人员需要考虑两个靶点在时间和空间上的存在问题：比如二者是否表达在同一细胞表面还是不同细胞？双抗是顺式还是反式地桥接两个抗原？是否不同的桥接方式会引起不同的生物学功能和副作用？

       七、展望未来双抗或者多抗的发展

       越来越多结构不同的双抗进入临床试验阶段。这些结构不同的双抗反映出了目前临床上的需求，也反映出研究者对生物学机理不同的理解。例如，T cell engager有很多不同的结构模式，包括不同的亲和力、靶点结合价数、结合域的几何结构、Fc区特性等。这些分子都将在临床实验中获得验证，看其双抗的设计是否能达到预期的临床治疗效果。作者们坚信，即便在不断涌现的新的治疗方式的冲击下，在接下来的10年，我们一定会见证双抗或者多抗在临床上成功用于治疗癌症和感染性疾病等多种未被满足的临床需求。

       参考文献

       1. Siwei Nie ， Z.W.， Maria Moscoso-Castro， Paul D'Souza， Can Lei， Jianqing Xu， Jijie Gu， biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics. Antibody Therapeutics， 2020.

       2. Labrijn， A.F.， et al.， Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. Nat Rev Drug Discov， 2019. 18(8): p. 585-608.

       3. Ellerman， D.， Bispecific T-cell engagers: Towards understanding variables influencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacy and safety. Methods， 2019. 154: p. 102-117.

       中文译者：沙文文

       中文审阅：聂思惟 王守业 张艺馨

       中文编辑：王宝龙

       关于华人抗体协会

       华人抗体协会是一个在美国马萨诸塞州注册的非营利、非政府的公益性组织，是第一个也是目前唯一一个全球性华人抗体专业组织。协会侧重关注治疗性抗体，并致力于创建一个全球性平台，以促进在治疗性抗体研发，生产以及商业化等领域的合作与交流。华人抗体协会与牛津大学出版社合作，出版发行同行评审英文专业期刊: Antibody Therapeutics。

       华人抗体协会网站：https://www.chineseantibody.org

       Antibody Therapeutics网站：https://academic.oup.com/abt

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